[发明专利]石斛DnMYB类转录因子、编码基因、载体、工程菌及应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种DNA片段的分离克隆和应用，特别涉及一种石斛DnMYB类转录因子、编码基因、载体、工程菌及应用。

（二）背景技术

石斛属（Dendrobium）植物是兰科（Orchidaceae）的附生植物，它是我国传统的名贵中药材，现代药理研究证明：石斛具有滋阴润肺、养胃生津、健脑明目、护肝利胆、清热解毒、补五脏之虚劳的神奇功效；对增强免疫力、抗衰老、抑制肿瘤、治疗糖尿病和萎缩性胃炎等都有确切疗效。

长期以来，药用石斛原料基本来源于野生资源，巨大的市场需求引起采挖过量，导致野生资源严重破坏，加上石斛自身的繁殖率低和生长缓慢等原因，致使野生石斛已处于濒危状态，价格也越来越昂贵。更为严重的是，由于乱挖滥采，野生石斛赖以生存的自然环境正面临毁灭性的破坏。

石斛属植物是以热带东南亚为中心向亚热带地区逐渐发展的类群，为附生植物，生长环境十分独特，常附生于海拔500-1800米的林中树干或湿润岩石上，对小气候环境要求十分严格，喜温暖湿润气候（陈心启等,1999）。石斛属植物属于菌根植物，根常与真菌共生生长，依靠共生真菌固定空气中的氮素供其生长利用，并依靠其气生根从潮湿的空气中吸收水分和养分；茎大多数呈肥大的假鳞茎，使其具有一定的耐旱和耐瘠薄能力，可以以其贮存水分和养分。

自然条件下，石斛生长极缓慢。近年来，由于人类过度采挖及环境的不断恶化，药材资源日趋枯竭。为保护利用这一珍稀中药材，增加产量，不少学者进行了石斛组织培养快繁研究，并取得了一定的进展。但试管苗移栽成活率低，产量低，目前还没能应用试管苗进行大面积栽培，不能满足药材市场的需求。因此石斛药源一直处于相当紧张状态，亟待解决。所以，石斛广泛的人工培育的前提，需要改良其根系，以满足移栽，存活和快速生长。

高等植物一系列调控逆境、激素、病原反应、生长发育等相关基因大多数是转录因子。转录因子又叫做反式作用因子，是指能够与真核基因启动子区域的顺式作用元件(cis-acting element)发生特异相互作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的作用，激活或抑制转录，调控对基因的表达。在植物的生长发育过程中，之所以各细胞之间出现了特定的分化，就是因为细胞内基因的表达存在时空的差异。而导致这种差异的主要原因之一就是转录因子在转录水平或转录后水平上的调节作用。

MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)转录因子是最大的植物转录因子家族成员之一，参与了细胞分化、细胞周期的调节，激素和环境因子应答，并对植物次生代谢以及叶片等器官形态建成具有重要的调节作用。大多数植物的MYB以在其N端含有一段约51～52个氨基组成的MYB结构域为共同特征，MYB蛋白的分类主要是根据这个高度保守的DNA结合结构域，这个结构域通常是由至多四个氨基酸残基序列的重复（R）组成，每一个都形成三个ａ-螺旋，每一个重复的第二个和第三个螺旋形成一个带有三个有规律的间隔色氨酸残基（或疏水的）的螺旋-转角-螺旋(HTH)结构，形成一个3D HTH疏水核心结构，对维持HTH的构型有极为重要的意义。

一些R2R3-MYB转录因子在植物的一种重要的次生代谢产物类黄酮的生物合成中起作用，例如，AtMYB11/PFG1等调控植物体所有组织的黄酮醇的生物合成(Frampton,2004)。杨文杰(2008)等人利用RACE技术从大豆栽培品种中豆27中克隆出了两个新的MYB基因命名为GmMYBZ1、GmMYBZ2，并通过酵母系统检测和实时定量PCR功能研究表明，GmMYBZ2可能也参与植物体类黄酮的生物合成调控。AtMYB75/PAP1等控制植物体营养组织中花青素的生物合成，AtMYB123/TT2、TT1与一个R2R3-MYB转录因子在拟南芥的次生代谢产物生物合成起协同调控作用，一同控制种皮中的原花青素(Pas)的生物合成(Ingo et al.,2011;Kanga et al.,2009)，PyMYB10、Purple、CsMYC2、NtAn2、MrMYB1等MYB转录因子基因在各种植物的幼苗期到成熟期等各个时期的花青素的生物合成中均起调控作用(Ban et al.,2007;Chiu et al.,2010;Cultrone et al.,2010;Pattanaik et al.,2011;Niu et al.,2010;Feng et al.,2010)。