[发明专利]荚用菜豆抗炭疽病分子诊断试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术中的分子标记辅助早期筛查抗炭疽病菜豆种质资源及新品种的试剂盒及其利用该试剂盒进行检测的方法。

背景技术

菜豆炭疽病是由菜豆炭疽菌[Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. et Magn.)Br. et Cav.]引起的一种真菌性病害，可侵染菜豆叶片、茎杆及豆荚等。感病品种一旦发病，减产在20%-30%；当温度和湿度适宜的情况下，减产甚至达到100%。此外，在菜豆种子繁殖田中该病发生也十分普遍，种子带菌现象严重。带病菌的种子用于菜豆种植基地生产，造成炭疽病发生呈现恶性循环的态势。据报道，已有炭疽病发生的地区包括北京、天津、河北、内蒙古、山西、辽宁、吉林、黑龙江、江苏、浙江、福建、江西、河南、湖南、广东、广西、四川、云南、陕西、台湾及香港等二十几个省市及地区等。

中国是世界上菜豆主产国之一，我国荚用菜豆产量位居世界第一，籽用菜豆产量列世界第三。目前我国荚用菜豆在生产上由于长期使用单一的品种和土地的连作等原因，许多菜田和繁种田炭疽病的发病率逐年升高。当温度13-26℃，相对湿度达到90%以上时容易发生此病。现阶段菜豆生产上对炭疽病防治主要采用化学药剂防治的方法，不仅耗费人力、物力，而且造成严重的农药残留。选育抗炭疽病菜豆品种是防治菜豆炭疽病最经济实用，也是最根本的解决方法。

我国十分重视菜豆抗炭疽病资源筛选和抗病育种，“八五”期间已经完成了种质资源库中保存资源抗病性的鉴定。有些育种单位还通过常规育种技术，选育出一批具有高抗和中抗的菜豆新品种，在生产上发挥了重要的作用，但由于选育周期较长，而且还消耗了大量的土地、人力和物力，所筛选出的品种远远不能满足生产上的需要。因此，依托生物技术，充分利用DNA分子标记遗传稳定性高，不受取材部位、时间、发育时期和环境的影响，操作简单、耗时少的优势，建立能在苗期就可对菜豆抗、感炭疽病性状进行大规模筛查的方法，对抗炭疽病菜豆新品种的选育具有重要意义。

在我国有关利用分子标记辅助育种方法对菜豆抗炭疽病进行抗病育种方面的研究未见报道。利用特异分子标记进行早期筛选的关键是筛选到与抗病相关的特异标记。

发明内容

本发明目的是克服常规抗炭疽病菜豆选种技术的不足，提供一种快速、早期、大规模筛选抗炭疽病菜豆种质资源和新品种的试剂盒及其利用该试剂盒进行检测的方法。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种用于荚用菜豆抗炭疽病分子诊断的特异性引物，其特征在于：

该特异性引物1为：GGATCCATGCAAGGAACCTCCAAAGAC；

特异性引物2为：ATTACTTGTGGAATTTTCCATGAGTCGACA。

本发明进一步公开了用于荚用菜豆抗炭疽病分子诊断的试剂盒，其特征在于它是由特异引物1：ACTTAACAAAATAAATAAACCTTAATT；特异引物2：ATCAATATTTTGTATCAGAAACCA；dNTP、Taq聚合酶、PCR缓冲液、DNA模板、无菌去离子水、6×上样缓冲液、TBE电泳缓冲液及标准阳性Marker组成。其中10×PCR缓冲溶液2.5μL、10mmol/L dNTP 0.2-0.8μL 、10μmol/L特异引物1和2各 0.5-1.5μL、菜豆基因组DNA 200-500ng、Taq聚合酶1-2单位、无菌水补至25μL。

本发明更进一步公开了采用此试剂盒在苗期对抗炭疽病菜豆品种进行筛查的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）一步法提取菜豆基因组DNA；

（2）基因组DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测；

（3）PCR扩增：在PCR扩增专用的薄壁离心管中加入：PCR缓冲溶液、dNTP、特异引物1、特异引物2、菜豆基因组DNA、Taq聚合酶、无菌水补至25微升，将装有上述液体的PCR专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为：90℃-95℃变性60-240秒，后进行90℃-95℃变性30-60秒，45℃-55℃退火40-60秒，70℃-74℃延伸120秒的扩增循环，循环数为30-45个，最后在70℃-74℃延伸480秒，扩增完成；