[发明专利]一种针对鼠传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种针对鼠传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法。

背景技术

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，也是目前核酸检测的主流技术，PCR产物的检测判定方法为琼脂糖凝胶电泳，而琼脂糖凝胶仅可区分相差约100bp的DNA片段。片段长度相差不大或者相等的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳将无能无力。另外，琼脂糖凝胶电泳通过紫外光激发荧光染料产生荧光来判断是否存在PCR产物，检测灵敏度相对较低。且琼脂糖凝胶电泳通过片段的大小对产物进行判断，特异性差，对非特异扩增的大小相似的片段不能区分。而且电泳时常用的染料如溴化乙锭等具有致癌性，常接触对身体健康不利。

鼠传疾病是一类严重影响人类健康的人兽共患疾病，人类历史上，鼠疫等传染病的流行和爆发给人类社会带来过巨大灾难。鼠类能携带200多种病原体，由于鼠类的繁殖力高和活动性强，加之人类的频繁活动、大量的国际贸易和快捷的交通，更增加了其活动范围和扩散的速度，而且有些鼠类可以无症状终生携带病毒，并经多种途径将鼠传疾病传染给人类或在动物间流行，这些特点决定了鼠传疾病的复杂性及多样性，也给鼠传疾病的控制带来了极大的困难。由于鼠传疾病复杂多样，有较高的病死率或致残率，因此进一步加强对鼠传疾病的认识，明确主要鼠传疾病的病原体，建立快速有效的鼠传疾病多重检测方法，对预防及阻断鼠传疾病的传播具有重要的现实意义。以往的研究都是针对一种病原体检测，且有些检测方法灵敏度不够高，不能够早期发现鼠传传染病的流行；此外，从生物学分类角度来看，鼠传病原体涉及细菌、病毒及立克次体、螺旋体等多种微生物学，目前鼠传病原监测仅是针对单种致病原，不同病原体分类专业人员分别从自身专业领域进行检测，浪费人力、财力，且各专业独力实施，不利于高效、综合采取防治措施。因而，对于鼠传病原的检测应当综合多重考虑。

悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片（liquid array,liquid chip），是一种非常灵活的多功能技术平台，可以进行蛋白、核酸等生物大分子检测、受体和配体识别分析等研究。悬浮芯片主要通过可偶联探针的荧光编码微球与两束激光检测，对被测物的定性和定量分析，一个反应孔内可以完成100种不同的生物学反应，从而实现对核酸的多重检测。但传统的悬浮芯片的检测方法耗时长，步骤繁琐，在多重检测中，由于多重探针的存在，杂交温度的选择也是一个技术开发时的瓶颈。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测灵敏度高，特异性好的针对鼠传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法。

为实现上述目的，本发明一种针对鼠传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，具体为：

1）根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性检测引物，并提交GENEBANK检测引物的特异性，合成时将上游引物5’末端连接特异Tag，下游引物5’末端进行生物素标记；

2）PCR反应结束后将反应产物分别与相应的编码微球杂交；

3）微球上的Anti-Tag在一定的条件下特异的捕获PCR产物上的Tag序列；

4）加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片LUMINEX系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析；

其中，所涉及的引物序列为：

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进一步，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段标签并且之间用间隔序列相连，下游引物5’端经生物素标记。

进一步，所述杂交中同时加入微球，PCR扩增产物，SA-PE，条件为42℃进行杂交，同时此条件下可以进行链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合。

一种改进的针对鼠传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，包括以下步骤：

1）PCR扩增待检样品；

2）加入相应的微球与PCR产物杂交；

3）上机对杂交后的微球进行检测；

其中，根据待检测的病毒，设计检测所用的特异引物，上游引物5’末端连接特异Tag，引物与Tag之间连接C9或C18作为加臂，下游引物5’末端进行生物素标记。

进一步，所涉及的引物序列为：

。

进一步，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段标签并且之间用间隔序列相连，下游引物5’端经生物素标记。