[发明专利]检测HIV-1病毒非核苷类抑制剂耐药突变法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。

背景技术

一、非核苷类逆转录酶抑制剂及其作用机制

获得性免疫缺陷综合症（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS），又称艾滋病，是世界十大致命疾病之一，其病原体为HIV-1病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV），HIV属于逆转录病毒，分为HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地区的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染。

HIV-1极易产生基因变异，在药物选择压力下形成了大量突变株，使临床应用的抗HIV药物迅速丧失临床效价，对目前的抗HIV治疗构成了严重的威胁。最早获准上市的抗HIV药物是靶向逆转录酶（Reverse transcriptase，RT）的核苷类逆转录酶抑制剂（Nucleoside RT inhibitors，nRTIs），但是该类药物具有严重的毒副作用。之后上市的非核苷类逆转录酶抑制剂（Non-nucleoside RT inhibitors,NNRTIs）具有高效低毒的优点，是目前高效抗逆转录疗法（Highly active antiretroviral therapy，HAART）的重要组成部分。

NNRTIs与核苷类化合物不同，其糖环部分为开链结构，因为缺少5’-位羟基，不能进行磷酰化，不参与DNA合成，它们和RT相互作用的机制不同于nRTIs，而是通过与HIV-1 RT的非底物结合部位结合，间接影响非底物结合部位的构型，产生抑制活性。HIV-1 RT是由p66/p51亚基组成的异二聚体酶，其中，p51亚基没有催化活性，仅具有构象调节作用。p66亚基由聚合酶活性域及RNase H活性域组成，聚合酶活性域由手指、手掌、拇指及链接4个亚结构域构成，其功能是以单链的病毒RNA为模板将三磷酸脱氧核苷(dNTP)有序地连接起来合成双链DNA。NNRTI是非竞争抑制剂，它与位于RT酶p66亚基手掌亚结构域上的结合位点（NNRTIs binding pocket，NNIBP）的结合引起的RT构象变化，破坏了DNA聚合酶催化位点的精确结合构象，尤其是β2-β3片层上高度保守的Y183-M184-D185-D186基序。此外，NNRTI的结合扭曲了组成“引物沟”结构元件的活性构象，干扰引物DNA链的精确定位，进而抑制DNA的聚合反应。

近年来，为克服nRTIs临床长期应用而引发的毒副作用，非核苷类化合物在治疗HIV-1方面得到迅速发展，如奈维雷平、地拉韦定和依非韦仑。

二、HIV-1病毒对非核苷类逆转录酶抑制剂的耐药类型及机制

NNRTIs长期临床应用也会产生耐药性，极大地限制了其临床应用。进一步研究表明，不同结构类型的NNRTIs所致HIV变异株各不相同，如双杂芳环呱嗪类化合物表现为HIV-1 RT第100位氨基酸变异产生抗药性，TIBO类则使其103位氨基酸变异，TSAO类又表现为138位氨基酸变异产生抗药性，双吡啶类会引起第106位氨基酸发生变化，吡啶酮类抗药部位在181位。而HEPT类化合物的耐药株病毒主要表现在第100位的亮氨酸变异为异亮氨酸，103位的赖氨酸变异为天门冬氨酸，106位的缬氨酸变异为组氨酸。

NNRTIs在临床使用时，NNIBP中单个氨基酸的突变直接影响药物的结合，经自然选择后，迅速出现耐药毒株。主要的NNRTI耐药突变有K103N/S、V106A/M、Y181C/L/V、Y188L/C/H和G190A/S/E；次要的NNRTI耐药突变有L100I、K101P、P225H、F227L、M230L和K238T，常常与1个主要NNRTI耐药突变联合出现。对第一代NNRTI耐药的变异株包括L100I、K103N、V106A、E138K、Y188I/C和Y188H,这些变异都位于NNIBP的内部或者周围。例如：(1)与NVP耐药性有关的Y181C、G190A和K103N突变;(2)与EFV耐药性有关的K103N突变;(3)与DLV突变有关的Y181C和K103N突变。此外，其他突变如T215Y/F、M41L、L210W、H208Y和V118I等也会使NNRTI产生耐药。其中，K103N、Y181C和G190A/S是最为严重的变异株，能使绝大多数NNRTI产生严重耐药。另外，NNRTI之间也普遍存在交叉耐药性。