[发明专利]香豆素衍生物及其制备方法以及弹性蛋白酶活性检测方法和检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种香豆素衍生物及其制备方法和在检测弹性蛋白酶的活性中的应用。

背景技术

现有技术测定弹性蛋白酶（EC号:3.4.21.37）活性的方法主要有三种。第一种是传统的高效液相色谱法（HPLC），该方法可以直接用于检测中性粒细胞弹性蛋白酶介导的水解纤维蛋白原反应。但是，高效液相色谱法实验过程繁琐、周期长、并且很难做到弹性蛋白酶抑制剂或促进剂的高通量筛选。第二种是紫外吸收光谱法，该方法操作简单、反应快速，目前已获得广泛的使用，但是这种方法存在以下两方面的缺陷：首先，紫外吸收光谱法的背景干扰大导致分析的灵敏度低。其次，用于分析的底物均为多肽衍生物或蛋白质，底物的制备成本高。目前普遍应用的第三种弹性蛋白酶活性的检测方法是荧光发射光谱法，该方法以多肽类为荧光探针，检测的灵敏度高、操作方法简单、并且可以用于高通量筛选。该方法的缺陷在于多肽类探针在常规条件下大都稳定性差，储存和运输条件苛刻，原子利用率低。

目前国内外还没有非肽荧光探针用于检测弹性蛋白酶活性及其抑制剂或促进剂筛选的报道。因此，设计开发基于非肽荧光探针的灵敏、性质稳定、操作简便、成本低廉的检测方法是非常迫切和必要的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有弹性蛋白酶活性检测技术中存在的缺陷，提供一种灵敏度高、性质稳定、操作简便、易于储运并且成本低廉的非肽弹性蛋白酶活性检测荧光探针和弹性蛋白酶活性检测方法。

为达到上述目的，本发明提供一种香豆素衍生物，该香豆素衍生物具有式（1）所示结构，其中，R₁为五氟乙基和七氟丙基中的一种，R₂为三氟甲基、甲基、氰基、吡啶环和苯并噻唑环中的一种；

式（1）。

本发明提供了上述香豆素衍生物的制备方法，该方法包括在亲核反应条件和缚酸剂存在下，在有机溶剂中，将式（2）所示结构化合物与酰氯或酸酐中的一种接触；

式（2）

其中，所述酰氯选自五氟丙酰氯、七氟丁酰氯中的一种，所述酸酐选自五氟丙酸酐、七氟丁酸酐中的一种。

本发明提供上述香豆素衍生物在检测弹性蛋白酶的活性中的应用。

本发明提供了一种弹性蛋白酶的活性的检测方法，该方法包括：将含有弹性蛋白酶的待测样品与本发明所述的香豆素衍生物接触，得到接触后的物料；检测接触后的物料在激发光下发出的荧光强度的增加值，所述荧光强度的增加值指示了待测样品中弹性蛋白酶的活性；所述激发光的波长为340-430nm，所述荧光的发射波长为450-520nm。

本发明同时提供一种弹性蛋白酶的活性的检测试剂盒，该检测试剂盒包括：本发明所述的香豆素衍生物、弹性蛋白酶标准品以及反应缓冲液。

本发明的香豆素衍生物在用于检测弹性蛋白酶活性时，与弹性蛋白酶具有更高的亲和力，检测的有效性更高。

本发明提供的香豆素衍生物荧光探针，在用于筛选弹性蛋白酶抑制剂时，与采用多肽类荧光探针相比，具有更高的灵敏度；并且本发明的有机小分子荧光探针，不会与抑制剂发生相互作用，避免了副反应发生对检测准确性的干扰，有利于弹性蛋白酶抑制剂或促进剂的发现。

因此，本发明提供的香豆素衍生物荧光探针用于与弹性蛋白酶活性检测有关的应用时的灵敏度高、与酶的亲和力高、荧光强度的变化范围广易于探查，原子利用率高，并且本发明的香豆素衍生物为非肽类的荧光探针，非肽类荧光探针相比于肽类荧光探针稳定性更高、使用更方便、价格更低廉。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1弹性蛋白酶催化荧光探针水解反应的示意图，其中hv表示：光子能量。

图2各种酶或蛋白质催化10μM荧光探针水解的相对速率。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种香豆素衍生物，该香豆素衍生物具有式（1）所示结构，其中，R₁为五氟乙基和七氟丙基中的一种，R₂为三氟甲基、甲基、氰基、吡啶环和苯并噻唑环中的一种；

式（1）。