[发明专利]具有肿瘤细胞靶向结合能力的短肽及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一组转铁蛋白受体结合肽，此类结合肽与高表达转铁蛋白受体的肿瘤细胞具有特异性高亲和力，能够作为肿瘤治疗药物的靶向载体，增加抗肿瘤药物对肿瘤细胞的特异性作用。

背景技术

转铁蛋白受体(TfR)介导的内吞作用是铁吸收、储存和利用的关键环节。Fe³⁺是核苷酸还原酶的一个辅因子，其主要功能之一是参与DNA复制的过程，对于细胞的生长是不可缺少的。

关于Fe³⁺进入细胞内的机理，目前国内外公认的机理是，转铁蛋白携带Fe³⁺结合到表达转铁蛋白受体的细胞上，通过胞吞转铁蛋白-Fe³⁺-转铁蛋白受体复合物进入内含体，ATP依赖的质子泵把H⁺泵到内涵体，PH值降低到5.5，在低PH下，转铁蛋白受体改变构象释放携带Fe³⁺的转铁蛋白。转铁蛋白一被释放就会立刻到达细胞表面，接下来转铁蛋白、Fe³⁺、转铁蛋白受体复合物就会如此循环运输Fe³⁺。正常情况下转铁蛋白结合Fe³⁺只会达到30％饱和的程度，通过转铁蛋白-转铁蛋白受体复合物进入细胞并不局限于Fe³⁺，铋，硼，钌，锝都会通过转铁蛋白-转铁蛋白受体复合物进入细胞。

转铁蛋白受体分子量约为90KDa，是II型跨膜糖蛋白，由胞外段、跨膜段与胞内段组成。到现在为止，已经发现了两类转铁蛋白受体，TfR1与TfR2，在很多细胞包括血红细胞、网织红细胞、肝细胞、单核细胞以及血脑屏障都发现有TfR1，而TfR2有两种转录形式存在(α-TfR2，β-TfR2)，而α-TfR2显著表达在肝细胞上，β-TfR2在很多细胞上呈低表达。

转铁蛋白受体几乎在所有的细胞上都有表达但表达量不同。与缓慢增殖的非肿瘤细胞相比，转铁蛋白受体在肿瘤细胞上的表达显著增加，这与肿瘤细胞快速分裂需摄入大量Fe³⁺有关。在很多肿瘤组织上与很多病例上都可以发现转铁蛋白受体是显著上调的，其上调与肿瘤阶段呈正相关，并且与治疗效果也有关。在前列腺癌细胞、口腔癌细胞、和肝癌细胞上，转铁蛋白受体的表达量比非肿瘤细胞至少要高出100倍，转铁蛋白受体的分子数目可以达到10000个。因此，转铁蛋白受体是肿瘤诊断与治疗的重要靶点。

相关报道表明，把植物药青蒿素、治疗性蛋白、寡核苷酸序列及核糖体失活蛋白如蓖麻毒素等共价连接到转铁蛋白上，就能达到靶向治疗作用，同时最大程度的降低了毒副作用。由Xenova开发的白喉毒素-转铁蛋白复合物已经用于治疗脑肿瘤病人。与传统的耐药性治疗效果相比，在一期与二期均起到的显著性的抗肿瘤的作用(Weaver，M.J.Neurooncol.65，3-13(2003))。

噬菌体展示技术是20世纪80年代兴起的一项蛋白质相互作用的技术，其可以用来抗原表位筛选、诊断试剂研究、疫苗研究、药物靶向研究。由于噬菌体展示技术可以将其表型与基因型联系一起，利用其配体独特的亲和力，结构简单，库容量大，所以将目的蛋白或短肽筛选出来再进一步开发成药物成为极大的可能性(Kazuki N.Sugahara，et al.Science328，1031(2010))。噬菌体展示技术已经成为开发药物的快速有效的方法。

本发明通过噬菌体随机展示7肽库对转铁蛋白受体进行筛选，最终得到了一组具有生物活性的短肽，并验证了此短肽与转铁蛋白受体具有良好的结合活性，能用于转铁蛋白受体的检测和作为肿瘤治疗药物的靶向载体。

发明内容

本发明的目的是提供一组新型转铁蛋白受体结合肽，其能够与转铁蛋白受体专一结合，并能够用于转铁蛋白受体的检测和作为肿瘤治疗药物的靶向载体。

本发明通过噬菌体随机展示7肽库对转铁蛋白受体进行筛选，最终得到了一组具有生物活性的短肽，对与转铁蛋白受体特异性结合的短肽的结构分析，确定了与转铁蛋白受体特异结合的氨基酸序列模式。

转铁蛋白受体结合肽的筛选与鉴定按照下述步骤进行：

(1)准备靶分子溶液，转铁蛋白受体用NaHCO₃溶液稀释16μg/ml包被酶标板，每孔150μl，4℃湿盒轻微震荡孵育过夜。如果需要稳定靶分子溶液，也可使用其他相似强度的离子溶液。

(2)挑取单克隆宿主菌大肠杆菌(购自New England Biolabs公司)ER2738于10ml含抗性的LB培养基里震荡培养。

(3)倾去包被液并扣去残余液，加进封闭液，封闭至少1小时。