[发明专利]一种裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法。

背景技术

以大肠杆菌为宿主菌大规模胞内表达重组蛋白过程中，在纯化目的重组蛋白前，需破碎菌体以释放目的蛋白，破菌后高分子量的宿主菌染色体核酸释放至裂解液中，导致裂解液黏度显著增加，给后续纯化工作带来困难。FDA对药用重组蛋白的核酸污染限度要求严格(每剂量应低于100pg)，因此去除核酸污染也是非常必要的。

非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶（phosphodiesterase）,专一性水解核酸的磷酸二酯酶为核酸酶。利用核酸酶降解核酸可降低破菌液的粘度。目前使破菌液中核酸降解以降低粘度的方法有两种：一种为添加外源核酸酶，如来自Serratia marcescens的Benzonase，其为经基因工程改进的核酸内切酶。其缺点在于费用过高不适宜于大规模生产。另一种替代方案是改造基因工程菌，使之能自动降解宿主染色体核酸。但是采用一般的重组方法改造菌株，效率很低。

金黄色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcus nuclease,简称SNase)是金黄色葡萄球菌分泌到胞外的一种核酸非专一性磷酸二酯酶，分子量16807道尔顿。该酶结构简单，为含有149个氨基酸残基的单链球蛋白，它不含半胱氨酸和二硫键，能够可逆地去折叠和重折叠，是研究蛋白质结构与功能之间的关系、蛋白质折叠动力学的重要模型。在Ca²⁺存在下，SNase可将DNA和RNA水解生成3'-单核苷酸和3'-二核苷酸，并表现出一定程度的序列特异性，倾向于作用AT富集区，能水解包括DNA、RNA，单链、双链、环形、线形的核酸。因此可在利用大肠杆菌表达重组蛋白时裂解宿主菌的核酸以降低破菌液的粘度，从而提高纯化效率。但在大肠杆菌中表达SNase时，也存在着表达量低，酶活不高，降解宿主染色体核酸的效果不明显的缺点。因此需要提供一种既可高效表达SNase且能快速生长的大肠杆菌以提高重组蛋白的纯化效率。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，旨在解决现有技术中利用大肠杆菌表达重组蛋白时裂解液粘度过高影响纯化的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，该方法包括以下步骤：

将pelB信号肽编码序列与金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列连接，得第一组合序列，其中该pelB信号肽编码序列在该金黄色葡萄球菌核酸酶基因序列上游；

将该第一组合序列与卡那霉素抗性基因序列连接，得到第二组合序列，其中第一组合序列在卡那霉素抗性基因序列上游；

用上述第二组合序列替换大肠杆菌JM109的ptsG基因序列，获得ptsG基因缺失的大肠杆菌JM109；

将上述ptsG基因缺失的大肠杆菌JM109中的第二组合序列中的卡那霉素抗性基因敲除。

本发明的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法具有如下优点：1、同源重组效率高；2、所得菌株能在37°C无抗性培养基条件下快速生长；3、制得的大肠杆菌表达的金黄色葡萄球菌核酸酶（SNase）可分泌至周质空间，直接发挥作用，简化纯化步骤；4、SNase基因表达的产物不会影响其它目的蛋白的表达，不会给宿主菌增加生长负荷；5、ptsG基因的敲除能降低发酵过程中乙酸的积累，减少细胞毒性，促进菌体生长。

附图说明

图1为本发明实施例的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法操作流程；

图2为本发明实施例的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法获得的第二组合序列的酶切检验电泳图；

图3为本发明实施例的裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法获得的ptsG::SNase重组大肠杆菌PCR鉴定图；

图4为本发明实施例1制备的目的重组大肠杆菌的SDS-PAGE电泳验证图；

图5为本发明实施例1制备的目的重组大肠杆菌表达的重组蛋白降解染色体DNA的电泳图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所用术语“敲除”为分子生物学常用术语，通常是指将某段特定基因或序列从宿主中完全地去掉。

本发明实施例提供一种裂解时自动降解核酸的大肠杆菌制备方法，包括以下步骤：