[发明专利]一种梅花鹿过氧化氢酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种梅花鹿过氧化氢酶及其制备方法。

背景技术

过氧化氢酶（Hydrogen Peroxidase）又称触酶（Catalase，CAT），是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶。真核生物的过氧化氢酶存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，是过氧化物酶体的标志酶，约占过氧化物酶体酶总量的40%。哺乳动物组织中过氧化氢酶含量差异很大，以肝脏中含量最高，结缔组织中含量最低。

过氧化氢酶的主要作用就是催化H₂O₂分解为H₂O和O₂，使H₂O₂不致于和O₂在铁螯合物的作用下反应生成非常有害的-OH，从而使细胞免于遭受毒害，它是生物防御体系的关键酶之一。鉴于含有过氧化物酶的抗氧化复合物可用于治疗，故认为过氧化氢酶也可用于治疗氧化损伤疾病。

过氧化氢酶自1950年就开始应用在工业生产中，广泛用于生物、医药、临床医学和食品领域中的某些分析测定，以及食品和乳制品工业、纺织工业、环保产业、制浆和造纸工业，在医疗器械的消毒、葡萄糖酸的生产等方面也有越来越多的应用。

目前商业化的动物源过氧化氢酶，主要以牛肝提取物为主。

梅花鹿为我国传统的珍贵药用动物，其产品在我国拥有悠久的药用历史。例如鹿茸，入药已有2000多年的历史，是一味名贵的滋补强壮的中药。明代李时珍《本草纲目》中记载有“鹿茸能生津补髓，养血益阳，强筋健骨，益气强志”。随着科学技术的发展，进一步证明了鹿茸的药理作用非常广泛，具有调节机体新陈代谢、促进各种生理机能活动的作用。

目前，梅花鹿过氧化氢酶基因为未知序列，尚未见报道。克隆鹿源过氧化氢酶，并对其基因序列进行分析，并表达重组蛋白，无论是在工业化应用领域，还是探究其药理价值，都具有重要意义。

发明内容

为获得梅花鹿过氧化氢酶基因序列并表达其重组蛋白，本发明提供了一种梅花鹿过氧化氢酶及其制备方法，本发明成功的克隆得到梅花鹿过氧化氢酶基因，对其基因序列进行分析并表达了其重组蛋白，无论是在工业化应用领域，还是探究其药理价值，都具有重要意义。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供了一种梅花鹿过氧化氢酶基因，所述梅花鹿过氧化氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述梅花鹿过氧化氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述梅花鹿过氧化氢酶基因来源于梅花鹿。

本发明还提供了一种梅花鹿过氧化氢酶基因的克隆方法，其特征在于：所述梅花鹿过氧化氢酶基因的克隆方法如下：

（1）从新鲜梅花鹿肝脏中分离提取总RNA，将mRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因；

（2）将步骤（1）所得目标基因进行DNA序列测定，并对该目标基因进行序列和功能分析，最终确定梅花鹿过氧化氢酶基因；

步骤（1）中所述的从新鲜梅花鹿肝脏中分离提取总RNA的具体步骤如下：

A．从低温中取出新鲜梅花鹿的肝脏组织，在液氮中将100mg组织碾磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1.5ml Ep管中，加入1.0ml的Trizol；

B．用1ml针筒，26-G号针头抽吸匀浆液两次以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌1.5ml Ep管中；

C．加入200ml氯仿/异戊醇或氯仿，剧烈振荡混匀30秒；所述氯仿/异戊醇的体积比为24∶1；

D．台式离心机上，12,000rpm，室温离心5 min；

E．转移上清液到RNase-free 1.5ml Ep管里，加入等体积异丙醇，室温放置5 min；

F．台式离心机上，12,000rpm，室温离心5min；

G．小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失；

H．用70%酒精洗涤两次，每次700μl，12,000rpm，室温离心2min；

I．尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失；

J．真空离心干燥3-5 min，或在室温下使酒精完全挥发；

K．沉淀用30-50μl DEPC-H₂O溶解。若沉淀难溶，68℃处理10 min；

L．凝胶电泳，确定RNA的完整性和污染情况；