[发明专利]一种梅花鹿过氧化氢酶及其制备方法

权利要求书

1.一种梅花鹿过氧化氢酶基因，其特征在于：所述梅花鹿过氧化氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种梅花鹿过氧化氢酶基因，其特征在于：所述梅花鹿过氧化氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的一种梅花鹿过氧化氢酶基因，其特征在于：所述梅花鹿过氧化氢酶基因来源于梅花鹿。

4.一种如权利要求1所述的一种梅花鹿过氧化氢酶基因的克隆方法，其特征在于：所述梅花鹿过氧化氢酶基因的克隆方法如下：

（1）从新鲜梅花鹿肝脏中分离提取总RNA，将mRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因；

（2）将步骤（1）所得目标基因进行DNA序列测定，并对该目标基因进行序列和功能分析，最终确定梅花鹿过氧化氢酶基因。

5.根据权利要求4所述的一种梅花鹿过氧化氢酶基因的克隆方法，其特征在于：步骤（1）中所述的从新鲜梅花鹿肝脏中分离提取总RNA的具体步骤如下：

A．从低温中取出新鲜梅花鹿的肝脏组织，在液氮中将100mg组织碾磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1.5ml Ep管中，加入1.0ml的Trizol；

B．用1ml针筒，26-G号针头抽吸匀浆液两次以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌1.5ml Ep管中；

C．加入200ml氯仿/异戊醇或氯仿，剧烈振荡混匀30秒；所述氯仿/异戊醇的体积比为24∶1；

D．台式离心机上，12000rpm，室温离心5 min；

E．转移上清液到RNase-free 1.5ml Ep管里，加入等体积异丙醇，室温放置5 min；

F．台式离心机上，12000rpm，室温离心5min；

G．小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失；

H．用70%酒精洗涤两次，每次700μl，12000rpm，室温离心2min；

I．尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失；

J．真空离心干燥3-5 min，或在室温下使酒精完全挥发；

K．沉淀用30-50μl DEPC-H₂O溶解；若沉淀难溶，68℃处理10 min；

L．凝胶电泳检测，确定RNA的完整性和污染情况；

步骤（1）中所述的mRNA反转录为cDNA的具体步骤如下：

a． 在PCR管中配制如下混合液共10μl：

总 RNA 1μl

50μM  Oligo dT（18） Primer 1μl

dNTPs Mixture 1μl

其余为RNase free ddH₂O；所述dNTPs Mixture中各脱氧核糖核苷三磷酸浓度为10mM；

b.  65℃保温5min后迅速在冰上冷却2min以上；

c.  离心数秒钟使模版RNA和引物等物质的混合液聚集于PCR管底部；

d.  在上述PCR管中配置如下反转录反应液，总体积为20μl：

上述混合液 10μl

5 X PrimeScript Buffer   4μl

40U/μl  RNase Inhibitor 0.5μl

200U/μl  PrimeScript Reverse Transcriptase 100～200untis

其余为RNase free ddH₂O；

e.  42℃保温30～60min；

f.  70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于PCR扩增。

6.根据权利要求4所述的一种梅花鹿过氧化氢酶基因的克隆方法，其特征在于：所述PCR扩增时所设计的引物为：

Cat+：5'-GCATCGCCACTCAGACAT-3'

Cat-：5'–CGATCCGTGGGTACAGG-3'。

7.一种梅花鹿过氧化氢酶，其特征在于：所述梅花鹿过氧化氢酶是由如权利要求1-3中任一所述的梅花鹿过氧化氢酶基因编码翻译而成。