[发明专利]可逆终端及其合成和在DNA合成测序中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及化学合成和生物化学领域，具体涉及一类可逆终端及其合成和在DNA合成测序中的用途。

背景技术

DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。

合成法测序(Sequencing By Synthesis，SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定，并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，分别控制四种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。

在合成法测序中，首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料，又叫“可逆终端”(reversible terminator)。这类核苷酸衍生物必须有一个可裂解的连接单元把核苷酸和荧光素连接起来。然后，在下一个指示核苷酸并入之前，在温和的条件下使该连接单元断裂，以便下一个可逆终端可以顺利并入，从而依次读出DNA碱基序列。该连接单元对合成法测序的读长和效率都有重要影响，因此，人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元，来提高DNA测序的效率。目前已报道的连接单元有光裂解、Pd催化裂解、氟化物可裂解等，但是这些连接单元目前仅限于基础研究，并不能实际应用(Accounts ofChemical Research 2010，43，551-563.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可逆终端及其合成和在DNA合成测序中的用途。该可逆终端具有还原敏感或酸敏感性。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种可逆终端，其结构式如式(I)所示：

其中R₁为荧光素，R₂为连接单元。该连接单元为两端均为活性官能团的可完全断裂的连接单元。

优选地，所述可逆终端的结构式如式(II)所示：

优选地，所述可逆终端是通过如下步骤合成的(如图2所示)：

A、化合物F₂的合成：在冰水浴搅拌条件下，摩尔比为1.0∶(1.2～2)的丙炔胺与三氟乙酸甲酯反应，得化合物F₂

B、化合物F₃的合成：在CuI、Pd(PPh₃)₄(四(三苯基膦)钯)和TEA(三乙胺)存在的条件下，化合物F₂和F₁反应，得化合物F₃所述F_1、F_2、CuI、Pd(PPh₃)₄和TEA的摩尔比为1∶(2～3)∶0.072∶0.025∶(1.5～2)；

C、化合物dUTP-NH₂的合成：化合物F₃与三正丁胺焦磷酸盐(E-4)、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dUTP-NH₂所述E-4、E-3和F₃的摩尔比为2∶2∶1；

D、化合物dUTP-SPDP的合成：在TEA存在的条件下，化合物dUTP-NH₂在碳酸钠碳酸氢钠缓冲液中，与以无水乙腈为溶剂的SPDP反应，得化合物dUTP-SPDP所述的dUTP-NH₂(即核苷酸U)和SPDP的摩尔比为1∶(1.5～3)；

E、化合物RDM-SH的合成：在DTT(二硫苏糖醇)存在的条件下，半胱胺在碳酸钠碳酸氢钠缓冲液中与化合物TAMRA(5/6)避光反应，得化合物RDM-SH所述TAMRA(5/6)、半胱胺和DTT的摩尔比为1∶(10～50)∶(40～70)；

F、化合物dUTP-T的合成：以Na₃PO₄-EDTA缓冲液(磷酸钠-乙二胺四乙酸缓冲液)和乙腈为溶剂，化合物dUTP-SPDP与RDM-SH反应，得化合物dUTP-T；所述RDM-SH、dUTP-SPDP的摩尔比为1∶(1～2)；所述化合物dUTP-T即具有式(II)所示结式的可裂解连接单元。