[发明专利]一种甲醇蛋白肽的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，特别是一种甲醇蛋白肽的生产方法。 

背景技术

应用发酵法生产单细胞蛋白作为饲料，在国内外已有较多报导，部分加工工艺较为成熟，如用假丝酵母、酿酒酵母等作为发酵菌种，以甜菜渣、啤酒糟、柑橘废渣、糖蜜等一些农副产品为原料生产的单细胞蛋白报道较多。目前，以甲醇为主要碳源生产单细胞蛋白的报道还不多，国内外生产甲醇蛋白的方法主要有细菌发酵法和酵母菌发酵法，细菌法包括英国的ICI法、德国的Hoechst-Uhde法和瑞典的Norprotein法；酵母菌种生产法包括日本的MGC法、法国的IFP法和美国的Philips Petroleum法，除ICI法工业化生产外（目前已停产），其他均未工业化。我国部分研究单位公布的实验室小试生产甲醇蛋白方法多是利用酵母菌生产单细胞蛋白，此蛋白的主要用作动物饲料添加。但研究表明，动物对此类蛋白的消化利用率较低，甚至出现消化不良的情况。 

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种甲醇蛋白肽的生产方法，可有效解决单细胞蛋白作为饲料添加剂后，出现消化不良、转化效率低的问题。 

本发明解决的技术方案是，包括如下步骤：首先将巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株接种至YPD试管斜面培养基上，培养得试管斜面种子，试管斜面种子接种到YPD液体培养基上，培养得摇瓶一级种子，摇瓶一级种子接种到pH值为4.5～5.0的BSM液体培养基上，培养得二级种子，将二级种子全部移种到发酵罐内的发酵培养基中进行甲醇蛋白的发酵生产，发酵72～84小时后，取样测定发酵液菌体湿重达300～360g/L，得发酵液，经灭活后用箱式隔膜压滤机进行板框过滤收集滤饼（即菌体蛋白），然后将滤饼置于发酵液储罐中，加入滤饼体积3倍的水稀释并搅拌均匀，得滤饼稀释液，再对滤饼稀释液降温至45～50℃，然后取蛋白酶粉（苏柯汉生物工程有限公司，产品型号SUKAPro AC PW 50，50000U/g），加水溶解，倒入滤饼稀释液（又称菌体蛋白稀释液）中，蛋白酶粉的用量为每立方米滤饼稀释液中加5Kg蛋白酶粉，酶解，当水解度达到75%以上时，得酶解液，灭活后，经箱式隔膜压滤机（820-U型，徐州市添缘压滤机厂）过滤，收集滤液、滤饼，回流再次酶解，收集压滤酶解液后用超滤膜（上海赛奥分离技术工程有限公司）进行超滤浓缩，最后向浓缩液添加淀粉并搅拌均匀，进行喷雾干燥，收集蛋白肽干粉，即得甲醇蛋白肽。 

本发明所用巴斯德毕赤酵母HGD-01菌体蛋白含量高达56%，能以甲醇为主要碳源，以氨水为氮源，辅以磷酸，二水硫酸钙，硫酸钾，七水硫酸镁，甘油和微量元素溶液等制成无机盐发酵培养基进行甲醇蛋白生产。本发明已对50L、500L及5m³发酵罐获得的甲醇蛋白进行甲醇蛋白肽的生产，经过5m³发酵罐中试验生产表明，本发明生产的单细胞蛋白具有蛋白肽含量高，氨基酸组成合理，B族维生素丰富的特点，可作为替代畜禽饲料蛋白的理想原料。 

具体实施方式

以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明。 

本发明包括如下步骤： 

1）、摇瓶一级种子培养

分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）HGD-01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342，保藏日期为：2012年9月12日；将巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株 0.5mL用划线法接种至YPD试管斜面培养基（试管规格180mm×20mm）上，30℃培养48小时，得试管斜面种子，取1支试管斜面种子，用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，接种到装有300mL YPD液体培养基的三角瓶中，瓶口用8层纱布包好，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养24～30小时后，菌体OD₆₀₀达到3～5，获得摇瓶一级种子；所述的YPD试管斜面培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物（oxiod公司产品，公知技术，以下同）、2%胰蛋白胨（oxiod公司产品，公知技术，以下同）、2%葡萄糖、2%琼脂（北京奥博星化学试剂有限公司产品，公知技术，以下同）和余量的水混合在一起组成；所述的YPD液体培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成； 

2）、二级种子培养