[发明专利]基因打靶载体及其利用方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及基因打靶载体及其利用方法。

【背景技术】

利用细胞所具备的同源重组能力，仅破坏基因组上的特定的基因、甚至可与人为地导入的DNA片段置换(非专利文献1、2)。将其称为基因打靶。此方法不仅一直在各种基因功能解析中发挥绝大的威力，也被期待为理想的基因治疗法或品种改良法(非专利文献3)。但是，一般在高等动植物细胞中的基因打靶的效率极其低，期望改良法的开发。使用在标志物基因中不具有启动子的外显子截留型的打靶载体，则知随机插入体的出现频度降低，可预期基因打靶效率的升高(非专利文献4、5)。但是，由于由向非目标基因中的随机插入也可发生标志物基因的表达，需求旨在进一步效率化的改良法的开发。

【现有技术文献】

【非专利文献】

非专利文献1：Capecchi，MR(1989)Altering the genome by homologous recombination.Science244：1288-1292

非专利文献2：Vasquez KM，Marburger K，Intody Z，et al.(2001)Manipulating the mammalian genome by homologous recombination.Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：8403-8410

非专利文献3：Yanez RJ，Porter AC(1998)Therapeutic gene targeting.Gene Ther5：149-159

非专利文献4：Bunz F，Dutriaux A，Lengauer C，et al.(1998)Requirement for p53及p21to Sustain G2Arrest After DNA Damage.Science282：1497-1501

非专利文献5：Adachi N，So S，Iiizumi S，et al.(2006)The human pre-B cell line Nalm-6is highly proficient in gene targeting by homologous recombination.DNA Cell Biol.25：19-24

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明旨在提供使高效率的基因打靶成为可能的基因打靶载体。

另外，本发明旨在提供利用使高效率的基因打靶成为可能的基因打靶载体，制作基因敲除细胞的方法。

【解决课题的技术方案】

基因打靶的效率极其低的问题的最大的原因在于高频度地发生了向细胞导入的打靶载体插入基因组上的随机的位置的反应(随机插入)。但是，因为可期待使用无启动子型的打靶载体来升高打靶效率，只要可简便迅速地制作这样的载体、特别是外显子截留型的打靶载体，则应可预期一定的技术革新。

本申请发明人开发了，在基因打靶载体(例如，外显子截留型的打靶载体)中，通过将IRES序列或2A序列等的使双顺反子性表达成为可能的DNA序列在选择标志物的5’上游上附加来升高基因打靶效率的技术(特愿2011-118564、2011年5月27日申请)。

但是，在特愿2011-118564的基因打靶载体中，由于不仅在正确打靶的克隆中，在发生向非目标基因中的随机插入的克隆中也发生筛选中使用的标志物基因(阳性选择标志物基因)的表达，阴性选择的效果说不上充分(图4A，B)。

本申请发明人通过向在特愿2011-118564的基因打靶载体中的目标部位的5’相同区域的上游附加具有剪接受体序列的自杀基因等的阴性选择标志物，通过使在引起随机插入的克隆的阳性选择标志物基因的表达不发生而成功地再升高基因打靶效率，从而完成本发明(图5)。再有，在本发明中认为，即使不向基因打靶载体附加成为阴性选择标志物的基因，通过向目标部位的5’相同区域的上游附加剪接受体序列，得到同样的效果(即，不发生在引起随机插入的克隆的筛选中使用的标志物基因的表达)。将本发明的方法命名为外显子截留阳性/阴性选择法(ExTraPNS法)。

本发明的要点如下。

(1)基因打靶载体，其具有与目标部位的5’上游区域相同的DNA和与目标部位的3’下游区域相同的DNA夹阳性选择标志物的结构，其中上述阳性选择标志物的5’上游附加有剪接受体部位和使双顺反子性表达成为可能的DNA序列，再者，上述与目标部位的5’上游区域相同的DNA的5’上游也附加有剪接受体部位。