[发明专利]用于选择性分子分析的系统和方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2011年11月17日提交的申请序列号为61/561,063且标题为“Selective Molecular Analysis System(选择性分子分析系统)”的美国临时专利申请的优先权，其全部公开内容通过引用并入到本文中。

背景

1、领域

本说明书涉及分子生物学领域，更具体的是涉及用于选择性分析一个基因或多个基因的特定等位基因的方法和系统以及其应用。

2、相关领域说明

基于核苷酸碱基特定基因序列中的变异将基因确定为“野生型(wild-type)”或“突变体(mutant)”。野生型基因一般是一个特定基因首次被识别的序列或一个特定基因最常出现的序列。突变体是具有野生型基因序列的至少一个核酸碱基发生变化的序列的任何基因。任何特定基因可能存在一个或多个突变，并且任何特定基因经常存在不只一个突变。在某些情况中，识别特定基因的特定突变是很重要的。这些情况中的突变通常是经遗传而得的，并且出现在有机体的所有体细胞中。

生殖系突变是经遗传而得的且存在于有机体的所有细胞内，因此纯合野生型或突变序列将存在于该有机体100％的总DNA中,而杂合序列一般存在于该有机体50％的总DNA中。相反，体细胞突变发生于有机体的个别细胞中,且可以在该特定有机体生存期的任何时候发生。因此,在细胞和其子代内将有杂合基因型。通常，含有突变的DNA将表示为来自整个样本的总DNA的极小百分比，并可低至或小于1％。使用等位基因分析所用的传统分子生物技术不能选择性地注意到该发生率非常小的突变。

因此，能选择性只识别由特定单个有机体的细胞样品纯化来的核酸混合物中的特定等位基因然后分析那些样品的感兴趣的特定突变的系统和方法，对研究人员和临床专业人员会非常有用。

发明概述

根据前述目的和优势，描述了用于选择性分析一个基因或多个基因的特定等位基因的方法和系统以及其应用。

根据一个方面，在样品中存在非靶DNA序列时，选择性扩增靶DNA序列的方法，该方法包括：(i)杂交条件下，使寡核苷酸体系与样品接触形成反应混合物，该寡核苷酸体系包括正向引物和反向引物，其中对正向或反向引物中的一个进行修饰以优先增加引物和靶序列之间的杂交，该修饰包括修饰的3'端核苷酸；(ii)使寡核苷酸体系循环(cycling)，从而使得如果该靶DNA序列存在于样品中，正向引物和反向引物与靶DNA序列杂交，且该反应混合物生成第一扩增产物；以及(ii)检测该第一扩增产物，其中该检测步骤包括使用靶DNA探针部分(component)检测靶DNA序列，该靶DNA探针部分包含第一修饰，其中该第一修饰优先增加靶DNA探针部分和第一扩增产物之间的杂交。

根据上述方法的第二方面，其中修饰的3'端核苷酸选自锁核酸、cLNA、桥接核酸(bridged nucleic acid)、拉链核酸(zip nucleic acid)、小沟结合体(minor groove binder)、肽核酸以及其组合。

根据上述方法的第二方面，该修饰的引物还包含一个或多个额外的修饰核苷酸。

根据上述方法的第三方面，其中该修饰的引物包含寡核苷酸序列5'-XYZ-3'，其中：(i)X包含一个或多个生物素基团；(ii)Y包含一个或多个核酸碱基；以及(iii)Z包含一个或多个修饰的核苷酸。根据一方面，Z包含选自锁核酸、cLNA、桥接核酸、拉链核酸、小沟结合体、肽核酸以及其组合中的至少一个修饰的核苷酸。根据另一方面，Z包含位于修饰的引物的3'端的两个连续的锁核酸。

根据上述方法的第四方面，其中该修饰的引物包含寡核苷酸序列5'-YZYZ-3'，其中：(i)Y包含一个或多个核苷酸；以及(ii)Z包含一个或多个修饰的核苷酸。

根据上述方法的第五方面，其中样品中的靶DNA序列与至少一些非靶DNA序列不同仅在于一个核酸。

根据上述方法的第六方面，其中检测第一扩增产物的步骤包括下列步骤：(i)提供包含一组特征的微阵列，该组特征包括用于检测靶DNA序列的靶DNA探针部分，并且还包括打算用作阳性对照的部分和打算用作阴性对照的部分；(ii)使微阵列与循环的反应混合物接触，以使第一扩增产物与靶DNA探针部分结合，其中这种结合引起发射可检测信号的特征；以及(iii)检测发射的可检测信号。