[发明专利]用于制备具有毒素、佐剂、检测标签和药代动力学半衰期延长剂的蛋白质的岩藻糖连接位点特异性缀合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及真核细胞，其用于生产具有在其糖部分上的非典型岩藻糖类似物和/或氨基酸的分子。本发明还涉及用于生产具有在其糖部分上的非典型岩藻糖类似物和/或氨基酸的分子的方法以及通过所述方法获得的分子。本发明还涉及用于生产缀合物的方法，所述缀合物包含具有在其糖部分上的非典型岩藻糖类似物和/或氨基酸之分子和药物活性化合物，以及本发明涉及可通过所述方法获得的缀合物。此外，本发明涉及特定的缀合物。

背景技术

目前，插入活性部分的预定连接点对于生物学产物的有效结合起关键作用。蛋白质和功能化合物的缀合通常通过将功能化合物连接至氨基酸残基的侧链来实现。已知的经典生物缀合技术以非位点限制的方式进行，这使得难以避免在关键氨基酸残基处的不期望缀合并且由于缀合反应结局的固有异质性也导致了有关批次间一致性的风险。借助与蛋白质连接的碳水化合物结构之羟基基团的非选择性化学偶联需要苛刻的反应条件并且具有蛋白质的氨基酸侧链中不希望之修饰的风险。非期望的偶联或修饰可影响的关键残基包含对于维持产物热稳定性和聚集倾向性来说重要的氨基酸侧链。对于抗体来说，不想要的在互补性决定区(CDR)内或邻近的氨基酸侧链的缀合可导致亲和力和异质性抗原结合特性的降低。化学偶联通常是通过蛋白质连接的官能团来实现，例如伯胺、巯基、羰基、碳水化合物、羧酸和羟基。用于经此类官能团偶联的反应性基团包括芳基叠氮化物、碳二亚胺、羰基、双吖丙啶(diazirine)、酰肼、羟甲基膦、亚氨酸酯、异氰酸酯、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-酯)、五氟苯基酯(PFP-酯)、补骨脂素(psoralen)和吡啶基二硫化物。

可以很容易地在巯基处引导缀合。然而，由于巯基的反应性，在表达的蛋白质中几乎不存在自由巯基。因而自由巯基的直接标记主要是依靠现有二硫键(S-S)的还原。在过去，作为治疗性蛋白质的主要群体之一的抗体已经通过巯基与功能性化合物相偶联。由于重链与轻链之间二硫键的还原发生的频率约为重链与重链之间二硫键还原频率的两倍，所以这种部分还原的方法具有由于轻链丢失而导致蛋白质破碎的风险(Sun，等人，Bioconjug Chem16：1282-1290(2005).)。特别的，关键的抗体CH2结构域的热稳定性可能会受到层间二硫键还原的负面影响。从这样的随机型巯基偶联反应生产均质产品是一个相当复杂和低效的过程。cAC10抗体药物缀合物的早期临床前版本--巯基连接的免疫缀合物--涉及每个抗体8个细胞毒性药物分子的连接(Doronina等，Nat.Biotechnol.21(7)：778-84(2003))。通过四个链内二硫键的还原获得实现偶联的半胱氨酸残基(Doronina等人，Nat.Biotechnol.21(7)：778-84(2003))。二硫键的不完全还原导致了具有负载的少于八个药物分子/抗体的不完整缀合物的异质混合物(Hamblett等人Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody-drug conjugate.Clinical Cancer Research，2004，10(20)：7063-70)。已证实对于巯基偶联的缀合物来说很难实现产品的均一性，并且总产率相当低(Hamblett等人2004)。