[发明专利]一种检测牛白血病病毒前DNA的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测牛白血病病毒前DNA的试剂盒及其应用。

背景技术

流行性牛白血病是由牛白血病病毒（Bovine leukemiavirus，BLV）引起的牛的一种慢性肿瘤性疾病。其特征为淋巴样细胞恶性增生，进行性恶病质和发病后的高死亡率。目前此病几乎遍及全世界各养牛国家，在我国于1976年首次发现于安徽合肥，继而在各省市相继发生。近年来，我国牛群该病血清阳性率逐年攀升，已从4％左右升高至30%～50%。无公害食品奶牛饲养兽医防疫准则（NY 5047－2001）和无公害食品肉牛饲养防疫准则（NY 5126-2002）均明确规定，一旦牛场发生牛白血病，一定要及时施行淘汰净化措施。另据文献报道，虽然该病的公共卫生学意义还未有定论，但从统计学意义上讲，感染BLV病毒能增加人罹患乳腺癌的可能性，亟需开展对该病的深入研究和调查。

虽然该病已在世界范围内传播，但目前还没有能有效控制或治疗该病的疫苗或方法,因而尽早诊断、及时淘汰病牛便显得尤为重要。现有的诊断方法对于群内BLV感染的普查通常是基于血清学试验如琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等,血清学试验虽然可以估计BLV在牛群内的流行情况，但是由于BLV病毒的被动抗体和主动感染产生的抗体无法区别，犊牛的母源抗体和母牛临产和产后的抗体检测会出现假阴性等因素都是血清学检测中的难题，而且血清学方法需要在感染3~16周后才能检测到抗体且抗体检出率很低，所以仅仅依靠抗体检测不能排除BLV感染的可能，也不利于疫病的早发现、早诊断、尽快采取相应措施。因此对于大量样品BLV的筛选、检测、确诊，非常有必要研发出特异性强，灵敏度高，操作相对简便的PCR检测试剂，来确定动物的感染状况。

各国为控制该病的感染采取了种种综合防治措施，包括淘汰、隔离和正确的管理，但这些措施都离不开有效的检测手段。目前，我国现行标准仅有2002年制订的该病琼脂扩散试验的检测方法，尚未制订该病荧光PCR方法的标准，也无针对该病病毒的Taqman荧光PCR试剂盒面世。传统BLV检测一般采用套式PCR扩增、目的片段测序和序列比对的方法，这种方法在PCR技术领域一直被普遍采用，但是其自身的缺点也比较明显：费时费力，程序繁琐，步骤复杂，周期长，人工成本高，不利于大量样本的检测；应用于临床基因诊断还存在许多局限性，主要表现在不能准确定量和因交叉污染而易产生假阳性等；且人员要求高，测序的结果需要具有一定专业知识人员进行序列比对才能最终判定结果，而荧光PCR结果判定简单、直观。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测全血中牛白血病病毒前DNA的试剂盒，所述的这种检测牛白血病病毒的试剂盒特异性强、敏感性高、成本低。

本发明提供了一种检测牛白血病病毒前DNA的试剂盒，所述试剂盒含有：a）荧光PCR反应液，b）荧光探针，c）热启动Taq酶，d）标准阳性模板，e）阴性对照，所述荧光PCR反应液中含有上、下游引物，其中，上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，为C1：5’-AACCCCACCTTCCCATGAC-3’；下游引物序列如SEQ ID NO：3所示，为C2：5’-TGGTAGGAGGTTAATCTGATTGTGAGT-3’；其作用是能够特异性扩增BLV前DNA的pol基因片段，所述荧光探针的5’端设计有荧光物质，3’端设计有淬灭物质，序列如SEQ ID NO：4所示，为荧光物质-CAGGCCCTTTCTCGAGCCCTCTG-淬灭物质，所述标准阳性模板的核苷酸插入序列如SEQ ID NO：5所示。

检测时所述上、下游引物单条的终浓度为0.05-1μM，优选为0.24μM。

所述荧光PCR反应液中还含有Mg²⁺，检测时所述Mg²⁺的终浓度为1.5-5.0mM，优选为2mM。

所述荧光PCR反应液中还含有四种dNTPs，包括dATP，dCTP，dGTP，dTTP，检测时所述各种dNTPs的终浓度分别为0.1-1mM，优选为0.25mM。

检测时所述荧光探针的终浓度为0.05-1μM，优选为0.2μM。

检测时所述热启动Taq酶的终浓度为0.01-5U/uL，优选为0.5U/μL。

所述荧光探针的序列5’端的荧光物质为FAM、HEX或VIC中的一种，3’端的淬灭物质为TAMRA。

优选地，所述荧光探针的序列为：

FAM-CAGGCCCTTTCTCGAGCCCTCTG-TAMRA。