[发明专利]柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及中药材鉴定技术，具体地说是一种柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法。

背景技术

柴胡为伞形科多年生草本植物柴胡(Bupleurum chinense DC.)和狭叶柴胡(南柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的根或全草，前者习称“北柴胡”，后者习称“南柴胡”。柴胡是我国传统名贵中药材，始载于《神农本草经》，列为上品。《本经》言：柴胡“主心腹肠胃结气，饮食积聚，寒热邪气，推陈致新。”现代用以疏散退热，疏肝解郁，升阳举陷。我国除海南省、香港澳门特别行政区外，其余地区均有柴胡属植物分布，已报道的柴胡属植物共有42种、17个变种及7变型，而《中国药典》(2010年版)中仅规定柴胡和狭叶柴胡两种为正品药用。柴胡药材的主要来源为野生资源，近年来由于临床需求不断增大，资源严重减少，使得大量伪品和混淆品出现，造成市场混乱。

目前，柴胡的鉴别主要依据外观性状，显微鉴别和理化性质等进行鉴别。性状鉴别和显微鉴别过于依赖鉴别人员的经验和感觉，主观性强，可信度较低。理化鉴别主要是柴胡皂苷a、d的检验，但是大部分柴胡的品种都含有柴胡皂苷，特征性不强，因而仅对柴胡皂苷a、d进行检验，也难以对柴胡进行准确鉴定。

DNA指纹鉴定技术是利用生物体内遗传信息载体(DNA)对物种进行鉴别的方法，近年来已被广泛的应用于中药材的鉴定，成为中药鉴定和质量标准研究的一个热点。目前广泛应用的构建DNA指纹图谱的分子标记方法有：限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)分析、随机扩增DNA多态性(RAPD)分析、小卫星DNA(VNTR)技术、微卫星(SSR)技术和扩增片段长度多态性(AFLP)分析。其中随机扩增DNA多态性(RAPD)分析技术是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，与其它分子标记技术相比，RAPD具有如下优点：

1.无需专门设计RAPD扩增反应引物，可以在没有任何分子生物学研究基础的情况下对某一物种进行DNA指纹图谱的构建和遗传多样性的研究；

2.多态性丰富，具有较高的检出率；

3.技术简便易行、省时省力，易于程序化；

4.所需的DNA样品量极少。

因而近年来RAPD技术目前运用相当广泛，但是RAPD技术目前还存在如下缺点：

1.重复性和稳定性较差；

2.虽然扩增结果多态性丰富但目前缺乏合适的检测手段；

3.大量的扩增条带使结果分析变得困难，目前常用的方法是在电泳图谱中选择代表性的扩增条带，根据这些条带的有、无进行鉴定。但人为的选择部分扩增条带而舍弃其它条带，降低了分析结果的客观性，增加了假阳性结果出现的几率。

高效毛细管电泳(CE)具有快速、灵敏、分辨率高、抗污染等优点。CE可以满足RAPD扩增产物对高分离度的要求，体现扩增结果的多态性；CE可明显缩短RAPD扩增产物分析时间，省时省力；CE分析结果可采用统计学方法处理，更适合RAPD扩增这种复杂结果的准确分析。本发明将高效毛细管电泳技术和随机扩增DNA多态性分析(RAPD)技术相结合，建立柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法，该方法快速、准确、客观，可用于柴胡样品的鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于药材真伪鉴别的柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法，以解决现有技术的缺陷。

本发明首先提供了柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱(包括柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱和狭叶柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱)，该指纹图谱可用于柴胡的真伪鉴别，柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱见附图1、附图2。

本发明还提供了上述柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱的构建方法，本方法包括下述步骤：

1)柴胡DNA提取：将柴胡样品粉碎，按CTAB法提取其线粒体DNA；

2)柴胡DNA的RAPD扩增：以提取的柴胡DNA为模板进行RAPD扩增，采用的引物为引物1(GTTACTCGAG)，引物2(CCTGAATGCC)。

3)PCR扩增产物的分析：采用毛细管电泳法分析扩增产物，记录电泳图谱；

4)柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱的建立：比较柴胡、狭叶柴胡和其它供试材料电泳图谱的区别，发现柴胡和狭叶柴胡均有其特异的电泳图谱，可以与其它供试材料区分。此电泳图谱即为柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱。

本发明还提供了柴胡毛细管电泳DNA指纹鉴定方法，它包含下述步骤：

1)先建立柴胡毛细管电泳DNA标准指纹图谱，方法如下：