[发明专利]一种检测蜡样芽孢杆菌核苷酸的方法及检测用引物和探针

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种检测蜡样芽孢杆菌核苷酸的方法及检测用引物和探针。 

背景技术

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种好氧、中温、产芽孢的革蓝氏阳性杆菌，广泛存在于土壤、水和空气尘埃中。菌株种类繁多，有益生菌株、低毒菌株和少数高毒力菌株，高毒力株常导致食物中毒事件暴发，是常见的食品污染菌。菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，1.0～1.2×3.0～5.0微米。产芽孢，芽孢圆型或柱形，中生或近中生，孢囊无明显膨大。无荚膜，运动。菌落大，表面粗糙，扁平，不规则。蜡状芽孢杆菌同苏芸金芽孢杆菌，炭疽孢杆菌组成蜡状芽孢杆菌群，它们的形态特征，生理生化特征相似度高，并有极高的DNA同源性。蜡状芽孢杆菌细菌对上界有害因子抵抗力强，分布广，是典型的菌体细胞，有部份菌株能产生肠毒素，可引起呕吐型和腹泻型两种不同类型的食物中毒，主要的食物有米饭、乳类、禽畜肉类、水果汁、发酵食品等。资料表明，B.cereus是北欧最常见的食物中毒致病菌之一，在我国B.cereus引起的食物中毒也很常见。腹泻型食物中则为多种肠毒素的作用结果，因此，除了要监测食物中蜡芽孢杆菌的数量外，了解其致病性也为极其重要。 

目前对该类蜡样芽孢杆菌的检测主要采用传统的细菌分离及生化鉴定方法，该方法费力，需要长时间进行选择性增菌过程，是一项费时费力的工作。另外，以蜡状芽孢杆菌营养体、芽孢表面抗原是免疫检测法可进行特异性检测。芽孢表面抗原是免疫快速检测的基础，但是血清试验很大程度上受到多克隆和单克隆抗体与其他抗原发生交叉反应的影响。 

发明内容

为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种检测蜡样芽孢杆菌核苷酸所用的检测引物和探针。 

本发明的另一目的在于提供所述检测蜡样芽孢杆菌核苷酸的方法。本发明所用的方法用于蜡样芽孢杆菌实时荧光RT-PCR检测，使得能够快速简单地判断样品是否有蜡样芽孢杆菌，为各种乳制品中致病菌检测提供了技术模式。 

一种检测蜡样芽孢杆菌核苷酸所用的检测引物和探针： 

分析已报道蜡样芽孢杆菌基因组序列，分别设计检测引物及荧光探针； 

所述的检测引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如下： 

检测正向引物BcF：5’-CATTCGTTCGCTGTGTGAACA-3’ 

检测反向引物BcR：5’-CCAACTTCAACCACAGGACAAA-3’ 

所述的荧光探针序列为： 

荧光探针BcY序列：5’-AGCCACCTAGCACACACGCCCAGA-3’ 

该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。 

所述的报告荧光染料优选为Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3或Cy5中的一种； 

所述的淬灭荧光染料优选为Tamra、Rox、Dabcy1、BHQ1或BHQ2中的一种； 

所述的检测蜡样芽孢杆菌核苷酸的方法，通过下述技术方案实现： 

（1）制备蜡样芽孢杆菌DNA模板 

将待检的含蜡样芽孢杆菌液用酚-氯仿法抽提基因组DNA，制备蜡样芽孢杆菌DNA模板。 

（2）进行实时荧光RT-PCR反应 

以步骤（1）中制备获得的蜡样芽孢杆菌DNA模板，进行实时荧光RT-PCR反应，即在25μL反应体系加入2.5μL10×PCR Buffer,2μL dNTP（各2.5mM），正向引物BcF和反向引物BcR（10μM）各1.5μL，0.5μL探针BcY（10μM），0.5μL Taq酶，5μL DNA，11.5μL RNase Free dH₂O。 

反应条件为95℃变性3min；以95℃反应5s，60℃反应40s扩增45个循环；在实时荧光PCR仪中反应，反应结束即可根据扩增曲线判定是否有蜡样芽孢杆菌。 

本发明的原理：