[发明专利]一种WHV-S蛋白基因及基于该基因的零背景DNA克隆载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于遗传工程中DNA重组的载体技术领域，尤其涉及一种WHV-S蛋白基因及基于该基因的零背景DNA克隆载体的构建方法。

背景技术

目前，DNA分子克隆所用载体中，绝大部分采用的还是普通载体。1999年美国学者发现：基因ccdB如果过量表达，具有杀伤大肠杆菌的作用。因而，近10多年来，形成了各种正性筛选克隆、表达载体，专利不下数十个，但是如果用Invitrogen公司的零背景（zero background）载体（含有自杀基因ccdB），不加外源DNA片段，直接用其pCR-II blunt，zero载体自身连接，会发现有大量蓝斑菌落产生，这说明与LacZα融合的ccdB蛋白的表达水平不足以杀伤实验室常用大肠杆菌菌株。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种WHV-S蛋白基因及基于该基因的零背景DNA克隆载体的构建方法，利用旱獭肝炎病毒（Woodchuck hepatitis virus， WHV）表面S蛋白（WHV-S）对细菌的细胞毒性构建零背景（自杀）克隆载体，以降低DNA克隆时空载体发生率，节省克隆鉴定成本和时间。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一种WHV-S蛋白基因，所述WHV-S蛋白基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列，所述WHV-S蛋白基因可以与蓝斑相关蛋白LacZα基因融合表达。

优选的，上述的一种WHV-S蛋白基因，其中：所述WHV-S蛋白基因编码的WHV-S蛋白具有序列表中SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

优选的，上述的一种WHV-S蛋白基因，其中：所述WHV-S蛋白基因编码全部或部分WHV-S蛋白序列、WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突变或杂交序列。

优选的，上述的一种WHV-S蛋白基因，其中：所述WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突变或杂交序列具有序列表中SEQ ID NO:3~ SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

优选的，上述的一种WHV-S蛋白基因，其中：还包括一具有序列表中SEQ ID NO:7的核苷酸序列的关键DNA序列，所述关键DNA序列编码的关键融合蛋白具有序列表中SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

一种基于上述的WHV-S蛋白基因的零背景DNA克隆载体，所述零背景DNA克隆载体包含或部分包含所述WHV-S蛋白基因DNA分子。

一种基于上述的WHV-S蛋白基因的零背景DNA克隆载体的构建方法，包括以下步骤：

步骤1）将所述的WHV-S蛋白基因与目标克隆载体质粒进行扩增、酶切和拼接；

步骤2）将步骤1）所得产物转化大肠杆菌感受态细胞；

步骤3）挑取步骤2）所得的大肠杆菌进行克隆，克隆鉴定后，扩增重组正确的质粒DNA；

步骤4）提取质粒DNA，进行DNA测序分析，得到的阳性重组质粒即为零背景DNA克隆载体质粒。

优选的，上述的零背景DNA克隆载体的构建方法，其中：所述步骤1）具体包括以下步骤：

步骤a）将野生型或人工合成的WHV-S蛋白基因进行PCR扩增，所述扩增的蛋白编码DNA至少包含WHV-S蛋白基因C末端50个氨基酸残基所对应的DNA序列，所述PCR产物DNA的3’-端添加终止密码，两端添加与DNA克隆载体适配的内切酶位点；

步骤b）将目标克隆载体进行PCR扩增，打开LacZα基因3’-末端，去除LacZα基因的固有终止密码，两端分别用内切酶处理；

步骤c）将步骤a）所得产物连接到步骤b）所得产物的LacZα基因的下游，构成一环状质粒载体。

优选的，上述的零背景DNA克隆载体的构建方法，其中：所述目标克隆载体是pUC系列的质粒载体。

优选的，上述的零背景DNA克隆载体的构建方法，其中：所述目标克隆载体为pUC18或pUC19。

本发明的零背景DNA克隆载体的构建方法，适用于包括克隆载体和表达载体在内的所有类型的载体的制备，其中表达载体包括原核表达载体、真菌表达载体、昆虫表达载体、哺乳类动物表达载体或植物表达载体。

本发明的突出效果为：本发明的零背景DNA克隆载体的构建方法提供了一种正性（Positive）筛选重组体的方法，降低DNA克隆时空载体发生率，节省克隆鉴定成本和时间同时，比现有技术中的“零背景载体”具有更少的蓝斑。