[发明专利]共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组腺相关病毒载体，特别是涉及一种共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重组腺相关病毒载体及其构建方法与其在制备预防和治疗关节炎（特别是类风湿性关节炎）药物中的应用。 

背景技术

类风湿性关节炎（RA）是一种主要累及关节的慢性自身免疫病，其特征为炎性细胞浸润和滑膜增生，导致关节软骨和骨破坏。RA发病机制复杂，许多因素参与其中，包括关键的促炎细胞因子TNFα和T淋巴细胞，二者被认为在RA进程中发挥重要作用。生物治疗尤其是TNF抑制剂已经在RA临床治疗中取得了巨大成功，包括p75TNFR-Fc融合蛋白，然而，仍然有相当一部分病人对此种治疗无效，因此迫切需要其它辅助或协同治疗方法。此外，鉴于RA发病机制的复杂性，联合阻断不同致病因素已成为很有吸引力的治疗策略，尤其是以T淋巴细胞为靶联合TNFα抑制。一些动物研究提示，联合阻断T淋巴细胞和TNFα，很可能比单独阻断TNFα能更有效地治疗RA。因此，TNFα抑制剂TNFR-Fc和T淋巴细胞抑制剂CTLA4-FasL的联合应用具有一定发展前景。 

T淋巴细胞在类风湿性关节炎（RA）发病的起始和进展过程中都发挥关键作用，在RA患者的关节腔和滑膜中均可观察到大量浸润的T淋巴细胞，因此清除T淋巴细胞成为RA治疗的一种有效策略。CTLA4-FasL融合分子将CTLA4胞外区和FasL胞外区融合在一起，一方面通过CTLA4功能域阻断T淋巴细胞激活的共刺激信号，另一方面通过FasL功能域诱导活化T淋巴细胞凋亡，从而通过共刺激阻断和凋亡诱导发挥对T淋巴细胞的双重抑制作用。在前期研究中，首先证明腺相关病毒 

(Adeno-associated virus，AAV)介导的CTLA4-FasL基因转移能够有效抑制大鼠佐剂诱导性关节炎（AIA，一种T淋巴细胞依赖的RA动物模型），并明显减少关节中T淋巴细胞浸润，进一步研究表明CTLA4-FasL比单独FasL分子能更有效地阻止关节炎的发展。 

以往的抗TNFα和抗T淋巴细胞联合治疗研究，应用的都是抗TNFα抗体和抗CD3或CD4抗体。鉴于高循环水平治疗蛋白在人体内产生的副作用，使用抗体或者蛋白进行联合治疗并不利于今后的临床应用，例如，使用etanercept（抗TNFα蛋白）和anakinra（抗IL-1抗体）会增加严重感染的风险。此外，包括TNFα抗体在内的重组蛋白体内半衰期比较短，需要反复注射，费用昂贵。因此使用双抗体或蛋白联 合治疗RA并不是理想的策略。 

内部核糖体进入位点(internal ibosome entry site，IRES)是小RNA病毒类中5’端非翻译区中的一段序列，其二级结构和三级结构构成了蛋白质翻译过程中核糖体的登陆平台，40s核糖体亚单位可以不依赖5’端帽子结构而在内部结合到mRNA上，从而直接对其后的结构基因进行翻译。IRES的这一特点可应用于构建同时表达两个基因的双顺反子真核表达载体。IRES是一个传统的介导双基因表达原件，但是由于其存在一些缺陷严重影响了其在多顺反子载体构建中的应用，主要有：（1）转录起始效率较低，通常造成下游基因明显低表达，IRES介导的上、下游基因表达量不平衡，通常下游基因的表达量仅是上游的20％-50％；(2)IRES自身结构较大，其应用常受到载体容量的限制。 

Furin裂解位点和2A自剪切序列作为一种新的技术方法，已被用于在单一开放阅读框中平衡共表达抗体重链和轻链。2A自剪切序列是由24个氨基酸组成的多肽，在最后两个氨基酸处完成自剪切，可介导上游基因和下游基因表达比例均衡，此外，2A序列肽不会引发体内特异的免疫反应。由于2A自剪切发生在2A肽C末端两个氨基酸残基之间，使得上游蛋白携带23个残留的2A肽段氨基酸，后者可能会影响上游蛋白的活性。为了消除残留的2A肽段可能产生的副影响，Furin裂解位点（RAKR）被引入到2A序列的上游，以去除残留的2A氨基酸。Furin是一种广泛存在于所有脊椎动物细胞的跨膜酶，可有效加工前体蛋白，它在许多细胞事件中发挥催化作用，并在许多疾病和感染中发挥作用。