[发明专利]共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重组腺相关病毒载体，是自上游至下游依次携带有TNFR-Fc基因、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4-FasL基因的重组腺相关病毒载体。

2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：用于构建上述重组腺相关病毒载体的出发载体为pAAV2-neo、pAAV2neo-EF1α、pAAV2neo-HRE或pSDAVneo-CAG等AAV2型载体，优选为pAAV2-neo，所述TNFR-Fc基因、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4-FasL基因位于载体pAAV2-neo中CMV启动子和BGH polyA尾两端的反向末端重复序列(ITR)之间。

3.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：所述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重组腺相关病毒载体为TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。

4.一种构建权利要求3所述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤：

1）合成编码人p75TNFR胞外区（NCBI Genebank No.NM_001066.2）的基因，在合成的人p75TNFR胞外区基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶Kpn I识别位点、Kozak序列、起始密码ATG、TNFR的原始信号肽、人p75TNFR胞外区基因、限制性内切酶Asc I和Pac I识别位点、终止密码子TGA和限制性内切酶EcoR I识别位点，在引入Asc I和Pac I识别位点时为了下游基因的正确编码，在Asc I识别位点后加了一个额外的碱基A、在Pac I识别位点后加了一个额外的碱基G，将此合成的人p75TNFR胞外区基因命名为(KpnI)Kozak-ATG-s ignal-TNFR(AscI-PacI)-TGA（EcoRI），其核苷酸序列如序列表中序列1所示，将该基因克隆入载体pGEM-T中；

2）合成编码IgG1Fc（NCBI GenBank:AJ294730.1）的基因，在合成的IgG1Fc基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶Asc I识别位点、IgG1Fc基因、6×His标签和限制性内切酶Pac I识别位点，并在Asc I识别位点后加一个额外的碱基A，在Pac I识别位点后加了一个额外的碱基G，将此合成的IgG1Fc基因命名为(AscI)IgG1Fc-His(PacI)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，将该基因克隆入载体pGEM-T中；

3）用限制性内切酶Kpn I和EcoR I将步骤1）合成的人p75TNFR胞外区基因(KpnI)Kozak-ATG-signal-TNFR(AscI-PacI)-TGA（EcoRI）从载体pGEM-T上切下，将其连接入同样经Kpn I和EcoR I双酶切的载体pAAV2-neo中，得到携带人p75TNFR胞外区基因的重组载体pAAV2/TNFR，然后用限制性内切酶Asc I和Pac I将步骤2）合成的IgG1Fc基因(AscI)IgG1Fc-His(PacI)从载体pGEM-T上切下，将其连接入同样经Asc I和Pac I双酶切的携带人p75TNFR胞外区基因的重组载体pAAV2/TNFR中，得到携带有TNFR-Fc融合基因的重组载体，命名为TRFC，在载体TRFC中，TNFR-Fc融合基因可命名为(KpnI)Kozak-ATG-signal-TNFR-(AscI)IgG1Fc-His(PacI)-TGA（EcoRI)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，TNFR-Fc融合基因的上游为CMV启动子，下游为BGH polyA尾，CMV启动子和BGH polyA尾的两端各有一个ITR序列；

4）合成5’端连接有Furin裂解位点氨基酸（RAKA）编码序列和2A自剪切肽编码序列的CTLA4-FasL融合基因，在合成的CTLA4-FasL融合基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶PacI识别位点、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列、人抑瘤素M信号肽编码序列、人CTLA4胞外区基因、人FasL胞外区基因、Flag标签编码序列、终止密码子TGA和限制性内切酶EcoR I识别位点，将此合成的CTLA4-FasL融合基因命名为(PacI)Furin-2A-M

signal-CTLA4-FasL-Flag-TGA(EcoRI），其核苷酸序列如序列表中序列4所示，将该融合基因用限制性内切酶Pac I和EcoR I酶切后，将其连接入经同样酶双酶切的TRFC载体中，得到自上游至下游依次携带有TNFR-Fc融合基因、Furin裂解位点氨基酸（RAKA）编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4-FasL融合基因的重组腺相关病毒载体，命名为TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示，在载体TFCF中，TNFR-Fc融合基因的上游为CMV启动子，CTLA4-FasL融合基因的下游为BGH polyA尾，CMV启动子和BGH polyA尾的两端各有一个ITR序列。