[发明专利]一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体及其高效表达金属硫蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，具体地说是一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体及其高效表达金属硫蛋白的方法。

背景技术

一般的，金属硫蛋白（Metallothioneins，简称MTs）是一类富含巯基、与金属离子具有高度亲和性的低分子量蛋白。金属硫蛋白在生物界广泛分布，含有61个氨基酸,其中20个氨基酸为半胱氨酸，少数有21个，每个分子可结合7-12个金属离子。由于MTs分子中富含巯基，从而使其在生物体中具有多种重要的生理功能，如重金属的解毒、体内微量元素的平衡调节、自由基的清除等等。由于具有广谱高效的保健效果和极高的医疗价值，可应用于包括医药、食品保健及化妆品添加剂、基因工程试剂、化学、环保、动物、农业等实验用品等等，前景十分广阔。

目前，国内主要采用兔肝或猪肝生产金属硫蛋白。该方法首先用重金属离子诱导猪、兔，使之产生金属硫蛋白，然后，宰杀取其肝脏提取其中的金属硫蛋白。然而，用该方法获得金属硫蛋白，设备投入大、转让费高、提纯步骤繁琐且产量极低（最高达8.6mg/g猪肝），需要消耗大量动物资源。现时，已有文献报道利用基因工程手段构建大肠杆菌工程菌生产金属硫蛋白的方法，然而产量较低（CN1141395C）。虽然融合蛋白表达技术为金属硫蛋白的表达提供了新方法（CN101144093B），但仍存在产率低这个不足之处(最高达25.2mg/L发酵液)。因此，急需寻找一种成本低、效果好、产量高、适合大规模生产的方法。

近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视。酵母是单细胞真核生物，不仅具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还安全，并具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题。其中，毕赤酵母表达系统具有遗传稳定、背景蛋白少、易高密度发酵、外源蛋白表达量高等优点，是目前应用最为广泛的酵母表达系统。已有300多种外源蛋白在该表达系统中获得表达，主要用于人类药物的生产。

发明内容

本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体及其高效表达金属硫蛋白的方法。

本发明的技术方案是按以下方式实现的，该多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体的获得方法是：将按照毕赤酵母密码子偏好性重新设计金属硫蛋白的编码序列，将所设计的金属硫蛋白基因插入载体pAO815上的EcoRI位点后，得到含单拷贝金属硫蛋白表达盒的表达载体，用限制性内切酶BglⅡ及BamHⅠ从得到的单拷贝表达载体上分离金属硫蛋白表达盒，将其再次插入到单拷贝表达载体的BamHⅠ位点，得到两个金属硫蛋白表达盒串联在一起的表达载体，重复上述插入程序构建出多拷贝表达的金属硫蛋白表达盒数目逐渐增加的重组表达载体。

所设计的金属硫蛋白的编码序列是SEQ ID NO.1 。

高效表达金属硫蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）构建多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体：

将按照毕赤酵母密码子偏好性重新设计金属硫蛋白的编码序列，将所设计的金属硫蛋白基因插入载体pAO815上的EcoRI位点后，得到含单拷贝金属硫蛋白表达盒的表达载体，用限制性内切酶BglⅡ及BamHⅠ从得到的单拷贝表达载体上分离金属硫蛋白表达盒，将其再次插入到单拷贝表达载体的BamHⅠ位点，得到两个金属硫蛋白表达盒串联在一起的表达载体，重复上述插入程序构建出多拷贝表达的金属硫蛋白表达盒数目逐渐增加的重组表达载体；

（2）将（1）中构建的重组表达载体转化毕赤酵母GS115或KM71中，在不含组氨酸的培养基上筛选到重组菌；

（3）将（2）筛选到的重组菌接种于BMGY培养液，28～30℃下快速振荡培养16～20小时，1500～3000g离心5分钟，收集菌体，用BMMY培养液重悬，稀释至OD_600nm约1.0，28～30℃下快速振荡培养至对数期加入甲醇至终浓度0.5%～1.5%，此后，每24小时向培养基中加入甲醇继续培养96～150小时； 

（4）收集菌体，超声破碎，离心收集上清，可从上清中分离纯化到金属硫蛋白。

本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：