[发明专利]一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的奇异变形杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明一株奇异变形杆菌及其应用，特别是一株产酸性氨基甲酸乙酯水解酶的奇异变形杆菌的筛选鉴定及其粗酶提取物降解氨基甲酸乙酯特性的研究。 

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate,EC)，在医学上有重要用途，曾一度被用作治疗多发性骨髓瘤及慢性骨髓性白血病，以及作为麻醉剂使用。近年研究发现，氨基甲酸乙酯是一种人类潜在致癌物质，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌等疾病，国际癌症研究机构在2007年把氨基甲酸乙酯列为2A类致癌物。氨基甲酸乙酯是一种伴随发酵食品（如酒精饮料、豆酱、酱油等）的生产过程中产生的副产物，对食品安全和生物体健康都有着严重的影响和危害。面对氨基甲酸乙酯所造成的食品安全问题，以微生物及酶降解实现食品中氨基甲酸乙酯的无危害化，是较理想的解决方案。 

奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)广泛存在于水、土壤腐败的有机物以及人和动物的肠道中。在肠道中一般不致病。能迅速分解尿素。此属细菌的O抗原与某些立克次体的部分抗原有交叉，可替代立克次体抗原与患者血清作凝集反应，此反应称为外斐试验，用于某些立克次体病的辅助诊断。 

发明内容

本发明的目的是提供一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的奇异变形杆菌（Proteusmirabilis）SW03，已于2012年10月19日保藏于中国典型微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CCTCC M2012416,保藏地址为中国武汉武汉大学。菌体的形态学特征为菌落圆形，表面干燥光滑，边缘规则，培养时间小于3天菌落为透明，大于三天培养菌落为黄色半透明，菌落大小0.2-0.5mm,可用营养肉汤培养基通气培养或用MRS培养基厌氧静置培养。菌体革兰氏阴性，有荚膜，1000×显微镜下观察细胞呈短杆状，见附图1。 

所述奇异变形杆菌分离自成年雌性小鼠胃部，其保藏条件如下：从生长良好的平板上挑取单菌落转接入营养肉汤培养基中，在30℃，200rpm，培养16h，取500μL培养液移入含有500μL40%甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。 

上述的营养肉汤培养基为二型营养肉汤培养基，配方为蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化钠5g，蒸馏水1L，如需固体培养基，再添加2%琼脂。 

本发明的另一个目的是提供上述奇异变形杆菌粗酶液的提取方法。 

本发明的另一个目的是提供上述奇异变形杆菌的应用，其合成的酸性氨基甲酸乙酯水解酶可以在pH小于5的条件下快速分解发酵食品中的副产物氨基甲酸乙酯并产生乙醇和氨气。 

本发明的另一个目的是提供上述奇异变形杆菌在酸性环境下分解尿素的应用，其合成的酸性脲酶可以在pH小于5的条件下快速分解发酵食品中的副产物尿素并产生二氧化碳和氨气以及其脲酶活性的检测方法。 

本发明提供的奇异变形杆菌能合成氨基甲酸乙酯水解酶以及脲酶，在pH4.8时具有最高酶活，能在酸性条件下快速分解氨基甲酸乙酯以及尿素。在pH为4.8的条件下，其氨基甲酸乙酯水解酶酶活为11.7U/g，脲酶酶活为10.2U/g。 

说明书附图 

图1奇异变形杆菌Proteus mirabilis显微照片 

图2pH对奇异变形杆菌氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影响 

具体实施方式

实施例1：奇异变形杆菌筛选方法 

将25g每只5周大雌性昆明小鼠进行五天的强饲氨基甲酸乙酯溶液(200mg/kg body weight/day)后解剖，并用浓度为0.9%的生理盐水冲洗小鼠胃肠道组织，取组织悬浮液1mL于1000×g下离心10min，取上清液接种于富集培养基中（牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaCl5g,氨基甲酸乙酯10g，水1000mL，pH7.0），30℃下通气培养20h。培养液于2000×g离心5分钟，取上清涂布于筛选培养基（牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaCl5g,氨基甲酸乙酯30g，琼脂20g，水1000mL，pH5.0）中培养三天。挑选菌落形态较大的菌株转移到营养肉汤培养基中培养20h后进行保藏。