[发明专利]3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药和绿色化学领域，具体涉及一种3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法。

背景技术

生物催化具有明显的绿色、高效和经济等特点。利用转氨酶选择性将酮基转化为氨基，是最重要的生物转化反应之一。

转氨酶(transaminase,amino transferase)是用于合成手性氨或氨基酸的一类酶。其中β-氨基酸类物质在药物合成中的应用十分广泛，可以用于合成一系列二肽肽酶-IV抑制剂，是重要的抗肿瘤、抗感染和治疗代谢紊乱的药物(Pharmacol.2004,404:239，BMC Endocr.Disord.2008,8:14)。在利用生物转化的方法制备β-氨基酸类物质的两种主要选择中，相较于步骤繁琐，收率较低的酶拆分法(Org.Biomol.Chem.2010,8:793-799，产物收率42%，光学纯度96%)，利用转氨酶直接合成的方法具有十分明显的优越性。而在利用化学合成方法合成该类物质的报道中，其收率较低(68%)，而且需要在高压和氢气、钌金属催化剂存在的条件下反应，安全性和环境友好性较差(Bioorg.Med.Chem.Lett.2007,17:2622)。

利用转氨酶进行生物转化的报道中，Codexis公司的Savile等人改造并利用来自节杆菌的转氨酶ATA-117，催化1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁烷-1,3-二酮转化为3-氨基-1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁烷-1-酮，即Merck公司的治疗糖尿病药物西他列汀(Sitagliptin，商品名JANUVIA)是利用转氨酶进行生物转化的优秀实例(Science2010,329:305)。

3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯是上述反应的模型底物之一，也是重要的潜在手性药物前体。但是，到目前为止，还未有利用转氨酶将3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯转化为3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用重组转氨酶将3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯转化为3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法，其以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子、氨基供体和助溶剂的存在下发生反应生成目标产物3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯，所述的生物催化剂为重组转氨酶，所述的重组转氨酶的制备方法为：将含有转氨酶的单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于35-40℃下活化8-12小时，将活化后得到的培养物转接到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于35-40℃下扩大培养至OD600值达到0.6-0.8，加入诱导剂，于25-35℃继续培养8-12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得到悬浮液，将悬浮液置于冰浴中超声波破碎8-12分钟，再离心，将上清液预冻至温度为-10~-25℃，然后再冻干24-48小时，即得重组转氨酶，所述的反应在pH为6.0-9.0的水相缓冲液中进行。

进一步地，在起始时的反应体系中，所述的重组转氨酶：所述的辅因子：所述的氨基供体：所述的3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的质量比为0.4-0.6：0.01-0.1：5-7：1。

优选地，所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖。

优选地，所述的辅因子为磷酸吡哆醛。

优选地，所述的氨基供体为异丙胺。

优选地，所述的助溶剂为二甲基亚砜。

优选地，所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲溶液或三乙醇胺盐酸缓冲溶液。

优选地，所述的反应在pH为7.0的水相缓冲液中进行。