[发明专利]鉴别欧洲牛肝菌近缘种的分子特异性标记引物及方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种鉴别欧洲牛肝菌近缘种Boletus appendiculatus与B. pseudoregius的分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对欧洲牛肝菌近缘种B. appendiculatus和B. pseudoregius进行快速辨别的方法。

（二）背景技术

隶属牛肝菌目Boletales下Boletus属的Appendiculati Konrad & Maubl. ex Lannoy & Estadès类群包括了Boletus appendiculatus Schaeff. : Fr.、B. subappendiculatus Dermek，Lazebn. & J. Veselsky、B. fechtneri Velen.、B. pseudoregius（Huber）Estadès 和 B. regius Krombh.五个Boletus近缘种。这五个近缘种均起源于欧洲，其共同特征为子实体的菌柄上或多或少有网纹，全菌柄呈一致黄色，菌管和菌孔经常变蓝；菌肉变蓝或不变蓝，但口尝总具温和口感；许多种在菌柄基部呈些许粉红色彩。

对近缘种B. appendiculatus与B. pseudoregius标本辨别的典型特征是B. appendiculatus的菌盖颜色为浅色到深褐色，不带有粉红色彩。而B. pseudoregius 的菌盖颜色为粉红色、暗红色、或带有粉红、淡红色彩的米色到赭黄色。宏观上的菌盖颜色差异是辨别这二个近缘种的唯一特征。但由于颜色差异易受生境、气候、土壤、子实体生长期、生理状况等的影响而常常导致主观判别上的偏差，而对于长期保藏的干标本，特别是对古老标本、模式标本的重新鉴别研究，仅凭颜色差异更是难以准确鉴定。因此，在大型真菌分类研究上，分子技术已成为了对标本辅助鉴定的重要手段。

真菌核糖体基因rRNA的内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS）的保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显，这一特点使得ITS区段不仅适合于属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析，而且非常适合于真菌物种的分子鉴定。对B. appendiculatus和B. pseudoregius的ITS区测序数据显示，B. appendiculatus和B. pseudoregius的ITS1-5.8S-ITS2序列长度均为600~690 bp，很难利用通用引物对（如ITS1/ITS4或ITS5/ITS4）的PCR扩增、普通电泳来进行准确辨别。对二个种的ITS序列比对显示二者的局部序列存在较大差异，这为设计ITS特异引物，针对性地扩增ITS特异片段，以方便用于这二个近缘种的分子辅助鉴定提供了可能性。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种可鉴别欧洲牛肝菌近缘种B. appendiculatus和B. pseudoregius的分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对欧洲牛肝菌近缘种B. appendiculatus和B. pseudoregius进行快速鉴别的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种鉴别欧洲牛肝菌Boletus appendiculatus和B. pseudoregius的分子特异性标记引物，其核苷酸序列如下：

上游引物：5′-TAGCTCACAGCCCACTCAATGT-3′

下游引物：5′-GGGATGGGACAGTCGGATAATGTT-3′

该引物对是采用PCR技术，经过对欧洲牛肝菌标本B. appendiculatus和B. pseudoregius的核糖体基因rRNA的ITS区序列的克隆测序，以得到的ITS序列进行碱基差异比对，并以此设计ITS特异性引物对。以该引物对对B. appendiculatus和B. pseudoregius进行PCR扩增，可从B. pseudoregius中获得481 bp大小的特异性片段。

本发明还涉及所述的分子特异性标记引物在鉴别欧洲牛肝菌B.  appendiculatus和B. pseudoregius中的应用。