[发明专利]鉴别欧洲牛肝菌近缘种的分子特异性标记引物及方法

权利要求书

1.一种鉴别欧洲牛肝菌B. appendiculatus和B. pseudoregius的分子特异性标记引物，其核苷酸序列如下：

上游引物：5′-TAGCTCACAGCCCACTCAATGT-3′

下游引物：5′-GGGATGGGACAGTCGGATAATGTT-3′。

2.如权利要求1所述的分子特异性标记引物在鉴别欧洲牛肝菌B. appendiculatus和B. pseudoregius中的应用。

3.一种利用如权利要求1所述分子特异性标记引物鉴别欧洲牛肝菌B.  appendiculatus和B. pseudoregius的方法，所述方法包括：提取待测牛肝菌标本基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现481 bp的DNA条带，则待测牛肝菌为B. pseudoregius，若电泳结果未出现481 bp的DNA条带，则待测牛肝菌为B. appendiculatus；

所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物：5′-TAGCTCACAGCCCACTCAATGT-3′

下游引物：5′-GGGATGGGACAGTCGGATAATGTT-3′。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下：94℃预变性6min后；94℃变性40s，65℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

5.如权利要求3所述的方法， 其特征在于方法如下：

（1）取待测牛肝菌标本子实体0.2 g，加液氮彻底磨碎，以SDS-CTAB法提取待测牛肝菌的基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：

PCR反应体系每25μL组成如下：

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；

（3）取步骤（2）扩增产物5μL，与1μL 0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现481 bp的DNA条带，则待测牛肝菌为B. pseudoregius，若电泳结果未出现481 bp的DNA条带，则待测牛肝菌为B. appendiculatus。