[发明专利]CIK细胞及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞及其制备方法和应用，特别是涉及一种CIK细胞（Cytokine-inducedkiller cells）及其制备方法和应用。

背景技术

外科手术、化疗、放疗是治疗恶性肿瘤的常规手段，这些方法均有一定的侵袭性，会损伤正常细胞，副作用大。肿瘤细胞免疫治疗，能特异性杀伤肿瘤细胞，而不会损伤正常细胞，副作用小，因而免疫治疗一直是抗肿瘤研究热点之一。

细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）是1991年Schmidt-wolf率先发现的，他采用人外周血单个核细胞，在体外经过多种细胞因子诱导扩增，获得的一群非MHC限制的异质细胞，具有强大的杀伤肿瘤细胞能力，其主要表面标志是CD3⁺CD56⁺。

CIK细胞与其他免疫细胞相比，具有增值速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、副作用小、对正常骨髓造血功能影响轻微等优点。

近20年来，国内外大量论文报道了自体CIK细胞治疗恶性肿瘤病人的结果。2010年，有学者报道了75例胃癌病人接受自体CIK细胞治疗联合化疗，中位生存时间为49个月，而对照组（单纯使用化疗）中位生存时间仅为27个月，即采用化疗联合CIK治疗后，肿瘤病人生存期延长1倍【孔炯，蒋敬庭，吴昌平．CIK细胞治疗胃癌者的相关临床因素对其预后的影响．临床肿瘤学杂志，2010，15(4)：295-299】。2011年，有学者评价了119例肾细胞癌患者接受自体CIK细胞治疗的结果，结果显示，CIK细胞治疗能显著改善III、IV期肾细胞癌患者的预后【张静，刘亮，于津浦．细胞因子诱导的杀伤细胞治疗肾细胞癌临床疗效的评价．中国肿瘤生物治疗杂志2011，18（5）：480-484】。

但是，肿瘤病人免疫功能受损，免疫细胞功能减弱，因此，来源于肿瘤病人外周血制备的CIK细胞杀伤肿瘤能力低下，影响CIK细胞疗效。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种CIK细胞及其制备方法和应用单个核细胞库及其构建和应用。本发明通过利用构建的正常健康人单个核细胞库诱导制备CIK细胞，获得的CIK细胞具有较强的增殖力，CD3⁺、CD8⁺和CD3⁺CD56⁺细胞的比例较高，并且具有较佳的治疗肿瘤效果。

为解决上述技术问题，本发明的CIK细胞的制备方法，包括步骤：

第一步，构建正常健康人单个核细胞库，其构建步骤包括：

（1）取正常健康人外周血，经检测后，收集外周血的单个核细胞部分，并对单个核细胞计数；

其中，所述检测包括：ABO/Rh血型检测和病原微生物免疫检测；病原微生物免疫检测包括：梅毒螺旋体血清学试验检测、HIV抗体检测、丙型肝炎抗体检测、乙型肝炎表面抗原检测、无菌试验检测；

收集外周血的单个核细胞部分的方法包括：方法A和方法B；其中，方法A，包括步骤：

1）经检测后的正常健康人外周血中，加入1～1.5倍体积的不含血清的细胞培养液或pH7.2PBS缓冲液稀释，充分混匀；

其中，细胞培养液包括：RPMI1640培养液和IMDM培养液；

2）将步骤1）获得的血液稀释液轻轻地加入到淋巴细胞分离液的界面上，注意不要破坏界面；

其中，血液稀释液与淋巴细胞分离液的体积比为2:1；

3）离心，收集中间层，获得单个核细胞；其中，离心的转速为1500～2500转/分钟，离心时间为15～20分钟，优选为2000转/分钟，离心时间为20分钟。本步骤中，经离心，血液会分层，红细胞位于底层，单个核细胞位于中间层。

方法B，包括步骤：（1）检测后的正常健康人，经采用血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集正常健康人的外周血单个核细胞。

（2）将步骤（1）收集的外周血的单个核细胞部分离心，弃去上清液，获得单个核细胞；其中，离心的转速为1000～1500转/分钟，离心的时间为7～10分钟。

（3）在单个核细胞中加入冷冻保护剂，经程序降温（如降温至-80℃）后，置于液氮中冷冻，并建立可供检索的细胞信息档案，从而构建出正常人的单个核细胞库；

其中，冷冻保护剂是含10%（体积百分比）DMSO的培养基，该培养基是由70%（体积百分比）RPMI1640培养液和20%（体积百分比）FBS（胎牛血清）所构成。

第二步，利用单个核细胞库诱导制备CIK细胞，其步骤包括：