[发明专利]CIK细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种CIK细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：

第一步，构建正常健康人单个核细胞库，其构建步骤包括：

（1）取正常健康人外周血，经检测后，收集外周血的单个核细胞部分，并对单个核细胞计数；

（2）将步骤（1）收集的外周血的单个核细胞部分离心，弃去上清液，获得单个核细胞；

（3）在单个核细胞中加入冷冻保护剂，经程序降温后，置于液氮中冷冻，并建立供检索的细胞信息档案，从而构建出正常人的单个核细胞库；

第二步，利用单个核细胞库诱导制备CIK细胞，其步骤包括：

解冻复苏冻存于单个核细胞库中的单个核细胞后，该细胞在γ干扰素、抗人CD3单克隆抗体和重组人IL-2的诱导下，或在γ干扰素、抗人CD3单克隆抗体、重组人IL-2和重组人IL-1，或在重组人纤维蛋白片段、抗人CD3单克隆抗体、γ干扰素、重组人IL-2的诱导下，或在重组人纤维蛋白片段、抗人CD3单克隆抗体、γ干扰素、重组人IL-2和重组人IL-1的诱导下，经诱导培养13～21天，其中，每隔2～3天传代培养一次，获得CIK细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，检测包括：ABO/Rh血型检测和病原微生物免疫检测；其中，病原微生物免疫检测包括：梅毒螺旋体血清学试验检测、HIV抗体检测、丙型肝炎抗体检测、乙型肝炎表面抗原检测、无菌试验检测。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，收集外周血的单个核细胞部分的方法包括：方法A和方法B；

其中，方法A包括步骤：

1）经检测后的正常健康人外周血中，加入1～1.5倍体积的不含血清的细胞培养液或pH7.2 PBS缓冲液稀释，充分混匀；

其中，细胞培养液包括：RPMI1640培养液和IMDM培养液；

2）将步骤1）获得的血液稀释液加入到淋巴细胞分离液的界面上；

3）1500～2500转/分钟，离心15～20分钟，收集中间层，获得单个核细胞；

方法B包括步骤：检测后的正常健康人，经采用血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集正常健康人的外周血单个核细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，离心的转速为1000～1500转/分钟，离心的时间为7～10分钟；

步骤（3）中，冷冻保护剂是含体积百分比为10%DMSO的培养基，该培养基是由体积百分比为70%RPMI1640培养液和体积百分比为20%FBS所构成；程序降温后，降温至-80℃。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第二步的利用单个核细胞库诱导制备CIK细胞中，其具体方法为采用方法I或方法II进行操作，其中，

方法I包括步骤：

①取单个核细胞库中的单个核细胞，解冻复苏；

②在复苏的单个核细胞中，按照1×10⁶/mL细胞，加入含500～2000IU/mLγ干扰素的完全培养基，开始诱导培养；

其中，完全培养基，包括：含体积百分比为10%FBS的RPMI1640细胞培养液；

③步骤②的细胞培养20～28小时后，加入50～1000ng/ml抗人CD3单克隆抗体和500～2000IU/ml重组人IL-2，继续诱导培养，其中，每隔2～3天传代培养一次，整个诱导培养的时间为13～21天，获得CIK细胞；

方法II包括步骤：

按照1×10⁶/mL复苏的单个核细胞，加入到包被有1～10μg/ml重组人纤维蛋白片段和1～10μg/ml抗人CD3单克隆抗体的培养板中，然后，加入500～2000IU/mlγ干扰素和500～2000IU/ml重组人IL-2，开始诱导培养，并用含500～2000IU/ml重组人IL-2的完全培养基或含500～2000IU/ml重组人IL-2和100～500IU/ml重组人IL-1的完全培养基进行传代培养，其中，每隔2～3天传代培养一次，整个诱导培养的时间为13～21天，获得CIK细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤③的继续诱导培养中，每2～3天用含500～2000IU/ml重组人IL-2的完全培养基或含500～2000IU/ml重组人IL-2和100～500IU/ml重组人IL-1的完全培养基传代培养。