[发明专利]一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR检测引物组、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR检测引物组、试剂盒及方法。

背景技术

鳢科鱼类（Channidae）是我国重要的淡水经济鱼类，在我国分布广泛，其肉质细嫩，味道鲜美，具有较高的营养价值，其中斑鳢(Channa maculata)和乌鳢(Channa argus)和以斑鳢为母本，乌鳢为父本杂交获得杂交鳢(Channa maculata♀ × C. argus♂)均是我国重要的养殖品种，也是我国外贸出口的重要淡水经济鱼类。随着我国池塘鳢科鱼类高密度养殖的发展，养殖鳢科鱼类病害的问题越来越严重，导致鳢科鱼类发病病原包括嗜水气单胞菌、诺卡氏菌、舒伯特气单胞菌等。鳢内脏类结节病是近年来新暴发的鳢科鱼类细菌性病，该病的特点是病鱼体表无明显变化，肝、脾、肾等内脏组织出现白色类结节症状，死亡率可达45%以上，通过分离鉴定确定该病的致病菌为舒伯特气单胞菌。自2009年首次报道以来，鳢内脏类结节病在全国范围内均有发生，近几年该病导致湖北省养殖乌鳢、广东省养殖斑鳢和杂交鳢大面积死亡，造成严重的经济损失。由于该病与鳢科鱼类另一主要疾病诺卡氏菌引起的结节病症状相似，养殖过程中容易误诊，错过最佳治疗时机。

因此，研发一种能快速、准确地检测致病性鳢源舒伯特气单胞菌的方法对于实验室进一步研究该菌及其致病机理具有极其重要的意义。

发明内容

针对现有技术所存在的问题，本发明的一个目的在于提供一组能快速、准确地对致病性鳢源舒伯特气单胞菌进行检测的双重PCR检测引物组。

本发明的另一个目的在于提供一种能快速、准确地对致病性鳢源舒伯特气单胞菌进行检测的双重PCR检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供一种能快速、准确地对致病性鳢源舒伯特气单胞菌进行检测的双重PCR检测方法。

本发明所采用的技术方案为：

一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR检测引物组，包括检测促旋酶的B亚单位基因（gyrB）的引物对和检测溶血素基因（hlyA）的引物对，序列分别如下：

gyrB引物对：

上游引物：TCAACTCCGCTGTCTCTAACCTG（SEQ ID NO.1），

下游引物：GCACCCTTACGGCAAGTCATC（SEQ ID NO.2）；

hlyA引物对：

上游引物：CAGGCTTCCAGCACTGAATACT（SEQ ID NO.3），

下游引物：CCAGTCCCACCACTTCACCT（SEQ ID NO.4）。

一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR检测试剂盒，包括：上述的检测引物组、10×PCR buffer、dNTP、MgCl₂、Taq DNA聚合酶、阳性质控品、阴性质控品。

所述阳性质控品为含有gyrB基因序列（GenBank登录号JQ319030）的T载体克隆和含有hlyA基因序列（GenBank登录号JX996182）的T载体克隆，阴性质控品为无菌ddH₂O。

一种检测致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR方法，包括以下步骤：

1)  从待检鳢的组织器官分离细菌；

2)  以分离菌株为模板，使用分别根据舒伯特气单胞菌的促旋酶的B亚单位基因（gyrB）、溶血素基因（hlyA）基因序列设计合成的两对引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物，其中引物序列如下：

gyrB引物对：

上游引物：TCAACTCCGCTGTCTCTAACCTG（SEQ ID NO.1），

下游引物：GCACCCTTACGGCAAGTCATC（SEQ ID NO.2）；

hlyA引物对：

上游引物：CAGGCTTCCAGCACTGAATACT（SEQ ID NO.3），

下游引物：CCAGTCCCACCACTTCACCT（SEQ ID NO.4）；

3）扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，然后根据电泳结果进行判定，其中gyrB扩增产物长601 bp，hlyA扩增产物长375 bp。