[发明专利]运用核酸恒温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森菌的试剂及其扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及病原体检验技术，具体地说是运用核酸恒温扩增反应来检测小肠结肠炎耶尔森菌的技术。

背景技术

小肠结肠炎耶尔森菌，属于肠杆菌科耶尔森菌属，是该菌属三种致病性菌之一。小肠结肠炎耶尔森菌是一种肠道病原菌，流行病学特点与假结核耶尔森菌很相似，感染率高于假结核耶尔森菌。该菌可在低温环境下生存，冰箱贮存食物是现代社会发生该菌感染的一个重要传染源。因此能够快速有效的检测小肠结肠炎耶尔森菌对于与之相关的疾病防控具有重要的意义。

小肠结肠炎耶尔森菌的检测方法有常规培养和生理生化反应检测等多种方法，与传统检测手段相比，本发明很好的解决了目前大多数检测技术手段的弊端。首先，无需任何复杂的仪器，只需要一台简单的加热器，如普通的水浴锅或以电、电池为能源的加热器，使得核酸诊断可以前所未有地用于现场诊断。其次，可以加快反应速度，缩短反应时间。第三，易于操作者掌握，对反应条件的要求相对宽松，使得以该技术为基础的产品对操作人员的技能要求不高，这也为核酸试剂的普及创造了条件。

发明内容

针对小肠结肠炎耶尔森菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用等温扩增技术快速、便捷、低成本的试剂和检测方法。

本发明提供了更加快速和低成本通过等温扩增方法检测小肠结肠炎耶尔森菌的方法。本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)设计特异性寡核苷酸引物用于等温扩增技术检测；

(2)整合各引物使之不相互干扰。

(3)以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；

(4)扩增完毕后可通过使用商业化的核酸恒温扩增检测试纸条对扩怎产物进行检测，阳性结果呈现两条紫红色条带，阴性结果呈现一条紫红色条带。

该方法包括：应用该方法检测小肠结肠炎耶尔森菌所使用的引物组和与之配套的等温扩增反应条件。其中引物序列如下：

该引物序列参照GenBank中的序列EU29431.1 Yersinia enterocoliticasubsp.enterocolitica strain ATCC 9610中16S-23S rDNA基因间序列为基础进行设计。

引物：

SEQ ID NO.1：5’-GAGGTCAGCGGTTCGA

SEQ ID NO.2：5’-TGTGGCTGCGAACACACT

SEQ ID NO.3：5’-GCGTCGTTGTGCAGTTTTTGTACTGCGGTCGCAAG

SEQ ID NO.4：5’-GCGTCGTTGTGCAGT

SEQ ID NO.5：5’-ACAGCAACCGGAGTGAAC。

其中序列SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5使用特殊基团标记，扩增产物中包含上述基团，以便同核酸恒温扩增检测试纸条反应。

本发明中反应体系中各组分构成比例如下：

其中Bst酶缓冲液的成分为20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、10mM KCl、2mM MgSO4、质量百分比0.1％Triton X-100、10mM dNTP，且pH为8.8。

等温扩增程序为：63℃60分钟。

扩增完毕后可通过使用商业化的核酸恒温扩增检测试纸条对扩怎产物进行检测，阳性结果呈现两条紫红色条带(分别为检测线和质控线)，阴性结果呈现一条紫红色条带(质控线)。

如出现其它结果则表明此次检验失败不能确定样品中是否存在小肠结肠炎耶尔森菌，需重新检验。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：相比传统生理生化检测方法，基于等温扩增的鉴定方法适用于直接从临床样品中扩增靶基因，只需要一次等温扩增反应就能够检测小肠结肠炎耶尔森菌是否存在，大大提高了效率节约了时间。相比较其它PCR方法，本方法制仅需要简单的设备——一个恒温水浴即可，大大提高了性价比节约了成本。等温扩增方法具有检测准确、特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目的病原体。它通过扩增靶基因，避免了反复培养，节约时间；该鉴定方法不受培养条件和病原体生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。

附图说明