[发明专利]检测水稻粒型的分子标记方法、试剂盒和引物

说明书

技术领域

本发明涉及水稻品种资源特性的检测技术，特别涉及检测水稻粒型基因的分子标记标记方法、试剂盒和引物。 

背景技术

水稻谷粒内、外稃的两缘相互勾合包被着糙米，在籽粒形成中起着重要的作用，一方面合成同化物，另一方面对籽粒进行塑型，影响稻米粒型、灌浆充实度和千粒重等。通过从水稻花发育突变体中分离克隆到相关的基因，以及利用已克隆的植物花发育基因的保守序列为探针从水稻基因组文库和cDNA文库筛选分离到与水稻花发育有关的A、B、C、D、E类基因。依据花器官突变体表型与相关基因的关系总结出调控单子叶植物花形态建成遗传控制的ABCDE模型假说。 

发明内容

为了能检测出水稻粒型性状的基因型，本发明的第一个目的是提供用于检测水稻粒型的特异性分子标记，本发明的第二个目的是提供采用上述的特异性分子标记检测水稻粒型的分子标记方法，本发明的第三个目的是提供采用上述的特异性分子标记检测水稻粒型的分子标记试剂盒。采用上述的特异性分子标记检测水稻植株粒型性状的基因型，具有准确性高，操作简单的特点。 

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案： 

用于检测水稻粒型的特异性分子标记，该特异性分子标记具有正向引物和反向引物，正向引物自5′端至3′端的核苷酸序列为AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5′端至3′端的核苷酸序列为TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案： 

检测水稻粒型的分子标记方法，该方法按以下步骤进行：提取水稻DNA，采用Caps分子标记mg进行PCR扩增，Caps分子标记mg包括正向引物和反向引物，正向引物自5′端至3′端的核苷酸序列为AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5′端至3′端的核苷酸序列为TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG，将PCR产物用BsrbⅠ酶切后，电泳检测：

1）检测水稻粒型性状显性纯合基因的特异性酶切片段分别为309bp和488bp；

2）检测水稻粒型性状隐性纯合基因的特异性酶切片段分别为63bp，241bp，488bp；

3）检测水稻粒型性状杂合基因的特异性酶切片段分别为：63bp，241bp，309bp，488bp。 

作为优选，上述提取水稻DNA的方法包括以下步骤： 

1）取新鲜水稻叶片3-5cm放入2.0mL离心管中，加入液氮并用竹筷研磨成粉末；

2）加入500μl的TPS抽提液，TPS抽提液包括100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0，1M KCl，灭菌后备用，65℃空气浴中放置1h，每隔30min颠倒混匀离心管中的沉淀；

3）12000rpm离心15min，移上清液约350μL于新离心管中，加入等体积的异丙醇，放入冰箱10min，再11000rpm离心10min；

4）弃上清液，再沉淀，加入1ml 70%酒精，8000rpm离心5min；

5）弃上清液，室温下白色的DNA沉淀风干后溶解于100μL灭菌ddH₂O，-20℃保存备用。

作为优选，上述的PCR反应体系如下： 

DNA 模板        1μl

2.5mM dNTPs     5μl

10×KOD buffer  12.5μl

10μM正向引物   1μl

10μM反向引物   1μl

1U/μl KOD酶    0.5μl

H₂O             4μl。

作为优选，上述的PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性60sec，65℃退火60sec，72℃延伸120sec，共34个循环；最后72℃延伸10min。 

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案： 

检测水稻粒型的分子标记试剂盒，该试剂盒包括Caps分子标记mg，Caps分子标记mg包括正向引物和反向引物，正向引物自5′端至3′端的核苷酸序列为AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5′端至3′端的核苷酸序列为TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。

本发明由于采用了上述的技术方案，只采取一次PCR和酶切就能检测出粒型性状的基因型，提高了检测效率，具有准确性高，操作简单的特点。