[发明专利]一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物及其方法

说明书

技术领域

本发明属于柑橘衰退病毒(CTV)检测领域。具体涉及用于褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR检测的引物及其方法。

背景技术

柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)是长线形病毒属(Closterovirus)的正义单链RNA(+ssRNA)病毒，是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒[1]。褐色橘蚜被普遍认为是其最主要的传播介体。由CTV引起的柑橘衰退病是柑橘生产中的重要病害之一，对柑橘产业造成了重大经济损失。监控CTV在田间的流行是控制柑橘衰退病扩大危害的重要策略之一，因此急需建立一种快速、灵敏且可靠的检测橘蚜体内CTV含量的方法，对更好的防治橘蚜传播CTV及深入研究蚜传机制有重大意义。在ELISA技术出现之前，明确蚜虫是否带毒一般通过传毒实验进行评价。血清学ELISA技术的建立推动了植物病毒的诊断，但由于非增殖型传播的病毒在昆虫体内浓度很低及血清学方法检测灵敏度较低，所以检测昆虫体内病毒比较困难。目前，PCR技术已广泛用来检测蚜虫体内带毒情况。对蚜虫体内的CTV成功检出的方法已有报道，主要有常规反转录多聚酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和反转录巢式多聚酶链式反应(reverse transcription-nested-polymerase chain reaction，RT-nested-PCR)，这只是定性检测。虽然Maria等及Edson Bertolini等分别用Real-time RT-PCR对蚜虫内CTV进行了定量检测，但TaqMan探针法成本较高，而应用SYBR Green I染料法检测橘蚜体内CTV尚无好的体系。

发明内容

为解决以上技术问题，为解决以上技术问题，本发明的目的之一在于提供一种柑橘衰退病毒特异性引物，用于荧光定量RT-PCR检测方法。

本发明目的之二在于提供一种用于褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR检测的方法。

本发明目的是这样实现的：

一种用于褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR检测的引物，其关键在于：其特异性引物为HD-F和HD-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。

上述外侧引物为LD-F/LD-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和4所示。

一种用于褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR检测的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)引物的制备：根据Genbank中CTV P25基因保守序列，利用Beacon Designer 7设计引物HD-F/HD-R及其外侧引物对LD-F/LD-R，并用Genbank的Blast进行比对，保证引物的特异性。在LD-F前加T7启动子序列和保护碱基得LD-T7-F，引物对LD-T7-F/LD-R构建标准品cRNA；

(2)褐色橘蚜总RNA的提取；

(3)目的基因的扩增与鉴定；

(4)标准品cRNA的制备；

(5)建立荧光定量RT-PCR体系；

(6)单头褐色橘蚜体内CTV含量检测：

当毒源植物开始抽梢时，用毛笔将无毒褐色橘蚜的无翅成蚜同时放置在毒源及健康植株的嫩梢上，每株毒源放置50头，健康植株上放置10头，当蚜虫在毒源植株及健康植株上取食24h后，用毛笔分别将褐色橘蚜轻轻挑到以干净的培养皿中，再随机取20头获毒蚜虫，单头分装于经DEPC水处理的EP管中进行抽提检测，同时取3头在健康植株上取食同样时间的蚜虫放于EP管中作为负对照与获毒蚜虫同时检测得到结果。

上述荧光定量RT-PCR体系中退火温度为60℃；引物浓度为600nm；

5μl反转录体系为：2×TS ReAction Mix 2.5μl；TrAnsScriptTM/RI Enzyme Mix0.25μl；gDNA Remover 0.25μl；HD-R 0.25μl；ddH₂O 0.25μl；蚜虫RNA模板或标准品1.5μl；程序为：42℃反转录30min；85℃变性5min.