[发明专利]一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物及其方法

权利要求书

1.一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物，其特征在于：其特异性引物为HD-F和HD-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。

2.根据权利要求1所述一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物，其特征在于，所述外侧引物为LD-F/LD-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和4所示。

3.一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)引物的设计：根据Genbank中CTVP25基因保守序列，利用Beacon Designer 7设计引物HD-F/HD-R及其外侧引物对LD-F/LD-R，并用Genbank的Blast进行比对，保证引物的特异性，在LD-F前加T7启动子序列和保护碱基得引物LD-T7-F，引物对LD-T7-F/LD-R构建标准品cRNA；

(2)褐色橘蚜总RNA的提取；

(3)目的基因的扩增与鉴定；

(4)标准品cRNA的制备；

(5)建立荧光定量RT-PCR体系，所述荧光定量RT-PCR体系中退火温度为60℃；引物浓度为600nm，体系如下：

5μl反转录体系为：2×TS ReAction Mix 2.5μl；TrAnsScriptTM/RI Enzyme Mix0.25μl；gDNA Remover 0.25μl；HD-R 0.25μl；ddH₂O 0.25μl；蚜虫RNA模板或标准品1.5μl；程序为：42℃反转录30min；85℃变性5min；

20μl实时定量PCR反应体系：2×SYBR Green Supermix)10μl；HD-F/R各1.2μl；ddH₂O 5.6μl；反转录产物cDNA模板2μl；扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环；扩增后采集融解曲线程序：95℃变性15s后，从65℃开始，每升高0.5℃停留30s采集荧光信号，直到温度升高到95℃融解曲线采集完成，每个样品3个技术重复，同时设负对照和空白对照；

(6)单头褐色橘蚜体内CTV含量检测。

4.根据权利要求3所述一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于：采用上述建立的体系对在毒源植物上获毒的单头蚜虫中CTV进行定量检测，得到单头橘蚜体内CTV含量，具体检测为：当毒源植物开始抽梢时，用毛笔将无毒褐色橘蚜的无翅成蚜同时放置在毒源及健康植株的嫩梢上，每株毒源放置50头，健康植株上放置10头，当蚜虫在毒源植株及健康植株上取食24h后，用毛笔分别将褐色橘蚜轻轻挑到以干净的培养皿中，再随机取20头获毒蚜虫，单头分装于经DEPC水处理的EP管中进行抽提检测，同时取3头在健康植株上取食同样时间的蚜虫放于EP管中作为负对照与获毒蚜虫同时检测得到结果。