[发明专利]环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种改进的环介导等温扩增新方法及其在检测贝氏柯克斯体中的应用。

背景技术

贝氏柯克斯体又称伯纳特柯克斯体(Coxiella burnetti)，俗称Q热立克次体，是引起Q热的病原体，属于立克次体科、立克次体族、柯克斯体属，为革兰阴性小杆菌或球杆菌，能通过细菌滤器。电镜观察，伯纳特柯克斯体整个细胞可分为三部分：由微荚膜、细胞壁和胞质膜构成的外表层；胞质膜内的含核糖体颗粒的致密外周层；由染色体细丝缠绕而成的中央致密体。系统发育研究表明，贝氏柯克斯体与其他立克次体亲缘关系相距甚远，它属变形菌纲的γ亚群，与肺炎军团菌关系密切。

贝氏柯克斯体的实验室检测常用血清学诊断和病原体分离，但耗时长、检出率不高。因此，国内外都相继将聚合酶链反应(PCR)技术用于其实验室检测的研究，其方式各有差异。

发明内容

针对现有技术存在必须经电泳凝胶成像才可以观察结果,或浊度仪显示的结果信噪比低的问题，本发明的目的在于提供一种具有操作简单、反应快速、耗时短等优点的环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法。

为实现上述目的，本发明环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法，包括：

根据贝氏柯克斯体com1基因序列作为靶序列，比对后选取保守区域，引物设计和合成过程中包括两个外引物和两个内引物的设计和合成，内引物FIP(上端内引物)包含Flc序列和F2(F2c区域的互补序列)，即5′-Flc-F2;内引物BIP(下端内引物)包含Blc(Bl区域的互补序列)和B2序列，即5’-Blc-B2。外引物为F3和B3序列，能特异结合靶序列上的6个特异区域。

第一组靶基因序列及设计引物位置：

5′-TCCACCATTATTTAGTCAACCACCCAGAAGTTTTAGTAGAAGTATCCCAAGCTCAACAAGCAATTAAAGAAAATGCAAAGGCAATGTTACATTGGTTGAATTTTTTGCAAATATCGTGAAACAAAATAAAAACCTCCGCGTTGTCTTCAAAGAACTGCCCATTTTTGGCGGCCAA-3’。

第二组靶基因序列及设计引物位置：

5’-AATACGCTGCCAAATCCACGACGCGCTGCTCAGTACAAATCACCCTAAATGTTGCTCAGCTCAAAAAAGACATGGATAATCCTGCTATAACTACAGCTAGCAGGCACCCCGACGTTCGTCATTGGTAATAAAGCGTTA-3’。

设计外引物和内引物为下面序列或其全部对应的互补序列：

第一组：

第二组：

进一步，所述外引物、内引物优选第一组。

进一步，所述外引物：内引物＝比例范围为1：4~1：12。

进一步，所述外引物：内引物＝1：8。

进一步，所述环介导等温扩增温度为58℃~66℃。

进一步，所述环介导等温扩增温度为63℃。

进一步，所述环介导等温扩增时间为15分钟~60分钟。

进一步，所述环介导等温扩增时间为40~60分钟。

进一步，所述非诊断性方法包括步骤：

①提取基因组DNA：取培养后菌液于EP管，离心，收集后，弃上清，用dH₂O重悬洗涤细菌，离心，弃上清，重复一次，最后用dH₂O重悬，沸水浴处理裂解细菌，离心，使细菌蛋白质等杂质沉淀于底部，取上清于EP管，上清即成DNA溶液，-20℃冰箱放置备用或采用基因组DNA提取试剂盒进行提取；

②利用所述外引物F3、B3和内引物FIP、BIP、样品基因组NDA、酶、缓冲液配制25μL反应体系；

③环介导等温扩增。

进一步，所述25μL反应体系组分如下：

进一步，所述等温扩增可采用恒温水浴、PCR、Real-time PCR、LC320浊度仪、GenieII。

另外外引物可以作为单独PCR扩增反应引物来检测贝氏柯克斯体。