[发明专利]一种小红酵母及其分离培养方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小红酵母及其分离培养方法与应用。

背景技术

小红酵母是环境真菌，少数种类为致病菌，可引起免疫抑制患者系统性感染(Thanos L,Mylona S,Kokkinaki A,Pomoni M,Tsiouris S,Batakis N.Multifocal skeletal tuberculosis with Rhodotorula minuta co-infection.Scand J Infect Dis.2006;38(4):309-11.)。

人类甲真菌病是由致病性真菌引起的甲板和甲下组织的真菌感染。甲真菌病主要由表皮癣菌如红色毛癣菌、须癣毛癣菌等，少数由酵母菌及非皮肤癣菌的丝状真菌引起。为一常见病，多发病。目前，临床将甲真菌病分为5种类型：浅表白甲型（superficial white onychomycosis）、远端侧位甲下型（distal and lateral subungual onychomycosis）、近端甲下型（proximal subungual onychomycosis）、甲内型(endonyx onychomycosis)和全甲毁损型(total distropic onychomycosis)。糖尿病、免疫受损患者及正常人群菌可发生此病。

目前尚无文献报道分离成功可引起人类甲真菌病的小红酵母，以及对该类小红酵母的流行病学和致病机制的深入研究。

发明内容

本发明的目的在于分离培养纯化一株新的可致人类甲真菌病的小红酵母（Rhodotorula minuta）菌株，并提供其分离培养纯化方法，以及该菌株在筛选抗真菌药物中的应用。

本发明提供了一株小红酵母（Rhodotorula minuta），已于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.6019。

该菌株是于2011年长征医院皮肤科在一名15岁免疫正常女性患者甲真菌病病甲中分离所得，经ITS测序和API 20C酵母鉴定试剂盒证实为小红酵母。

本发明的小红酵母（Rhodotorula minuta）菌株CGMCC No.6019属担子菌门（Basidiomycota），担孢目（Sporidiales）,红酵母属（Rhodotorula）。

1.形态特征：

病甲用10%KOH处理后于光镜下可见小的、椭圆形酵母，3.5-6.5×3.5μm。

2.培养特征：

该菌可在麦芽浸出培养基（MEA；Oxoid,Basingstoke,UK）上25℃培养时表现为粉红色、光滑菌落，边界清楚。

3.碳源利用：

可同化葡萄糖、蔗糖、甘油、琥珀酸盐。尿素试验阳性。

所述小红酵母ITS1、5.8S rDNA和ITS2区扩增测序方法：采用真菌通用引物

上游引物ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’(如SEQ ID NO:1所示)；

下游引物ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(如SEQ ID NO:2所示)。

以基因组扩增，PCR反应体系50μL：10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP混合物8μL，10umol/L引物各1ul，模板2ul，Taq酶0.5ul，无菌水32.5μL。PCR扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，70℃延伸2分钟，30个循环；72℃保存10分钟。所得扩增产物由ABI 3730DNA自动测序仪双向测序两次。测序结果如SEQ ID NO:3所示；将测序结果于NCBI网站进行序列比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），同小红酵母CBS4407比同源性99%。

本发明还提供了所述的小红酵母的分离培养纯化方法，该方法包括：

小红酵母接种于沙氏琼脂培养基平板，25℃，第3天生长，得到小红酵母菌落；