[发明专利]柯萨奇病毒A10核酸检测用引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及柯萨奇病毒A10核酸检测用引物、探针及试剂盒。

技术背景

柯萨奇病毒A10(coxsackievirusA10，简称CVA10)为单股正链RNA病毒，属小RNA病毒科(Picoranviridae)，根据其分子遗传特征，CVA10属于人类肠道病毒A类(human enterovirus A,简称HEV-A)。CVA10作为人类感染性疾病的一种病原，能引起多种疾病，如手足口病、疱疹性咽峡炎及脱甲病等。手足口病的一种主要病原体人类肠道病毒71(human enterovirus 71,简称HEV71)已在亚太地区流行了十多年，在中国大陆自1998年以来一直以C4基因型循环传播。然而，在近几年爆发的几起手足口病中，除了主要病原体HEV71外，还有多种人类肠道病毒参与感染，其中CVA10就是常见的一种。并且，近几年CVA10开始在欧洲流行，且有在全球流行并引起流行病爆发的可能。如2008芬兰爆发的手足口病，2010法国爆发的疱疹性咽峡炎和手足口病都以CVA10和CVA6为主，CVA10还引起了2008年西班牙的手足口病的流行，并引发了脱甲病。另外，健康人群人类肠道病毒隐性感染的调查结果显示HEV-A表现出高度的流行，其中CVA10是其中之一。我国深圳地区近几年手足口病的病原学调查结果显示，CVA10的感染比例表现出上升的趋势。

CVA10的感染一年四季均可发生，其主要通过粪-口途径在人群中传播，带毒的粪便可通过污染的手、餐具、食物经口进入人体，咳嗽、打喷嚏形成的飞沫可直接或间接进行传播，另外，接触病人破溃的疱疹液等也受到感染。CVA10作为一种潜在的威胁，为了更好地应对CVA10的感染所引发的疾病流行，提供一种快速、准确的检测技术显的尤为重要。

本发明选择柯萨奇病毒A10的VP1基因设计用于荧光RT-PCR检测的引物及探针序列，建立了柯萨奇病毒A10荧光RT-PCR检测技术，反应结束即可根据扩增曲线判定是否感染柯萨奇病毒A10。

发明内容

本发明目的在于提供用于柯萨奇病毒A10实时荧光RT-PCR检测的引物、探针及试剂盒。

本发明在分析已报道的柯萨奇病毒A10VP1基因序列基础上，分别设计引物及荧光探针，所述的引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列分别如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示。

本发明设计的探针的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。其中，报告荧光染料可以采用下列荧光基团中的任意一种：FAM、HEX、TET、JOE、ROX和CY5，淬灭荧光染料可采用下列荧光基团中的任意一种：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2和BHQ3。

根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记有两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对柯萨奇病毒A10核酸的实时检测。

本发明提供的试剂盒，包括上述正向引物和反向引物。

优选地，试剂盒还包括上述探针。

优选地，试剂盒还包括实时荧光RT-PCR反应液，与所述正向引物、反向引物和探针共同构成实时荧光RT-PCR检测体系，25μl所述实时荧光RT-PCR检测体系的配置为：2×OneStep RT-PCR Buffer 12.5μl，10μM所述正向引物1.5μl，10μM所述反向引物1.5μl，10μM所述探针0.5μl，Rox Reference Dye Ⅱ(50×)0.5μl，5U/μl Ex Taq HS 0.5μl，40U/μlPrimeScript RT enzyme Mix 0.5μl，RNA 5μl，RNase Free dH₂O 2.5μl。

优选地，试剂盒的检测反应条件为：50℃反转录20min，95℃变性3min，以95℃15s，60℃40s(收集荧光信号FAM)扩增45个循环。

当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其他类型的探针，以适用不同方法的荧光PCR检测。