[发明专利]一种检测柯萨奇病毒A16型RNA的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明提供一种提取纯化和检测柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus A16，CA16）RNA的方法，并提供一种相应的检测CA16RNA的试剂盒。

背景技术

实时荧光PCR技术（FQ-PCR）把PCR、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行。实时荧光PCR技术与其它检测技术相比具有以下优势：（1）与免疫学检测比较，其具有更高的灵敏度，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以检测出来。（2）根据各种病原体独特的保守基因序列设计引物，能够保证PCR反应的高度特异性，避免交叉反应。（3）能对病毒进行定量检测，可反映出患者体内病原体拷贝数的高低和复制情况。定量检测有助于判断病原体感染与疾病发生和发展的关系，探讨药物对病原体的作用，了解感染疾病病人用药后病情的变化情况。这对理解发病机制和预测抗病毒治疗的有效性十分关键。（4）可扩大检测人群的范围，适用于大规模的流行病调查。对如手足口病这类自然感染率极高的病原微生物尤其适用。（5）将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤（6）全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染。（7）实时检测技术可连续不断的检测PCR过程中荣耀信号的变化，避免了传统PCR的“平台期效应”，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值算出，准确性和灵敏性都有提高。

目前，国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测CA16-RNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的CA16-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒存在很多不足之处：1）检测灵敏度低，约在1000copie/ml左右；检测范围窄，一般在1.00E+03copie/ml～1.00E+07copie/ml之间，对于临床高值（大于5.00E+07copie/ml）和低值（小于1.00E+03copie/ml）的样本无法检测；2）对于CA16的不同亚型存在一定的漏检现象；3）酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；4）无法有效去除样本中的PCR抑制物（如：全血、痰液等），体系中一般没有阳性内对照（即内标），无法预防假阴性；5）国外试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。

磁珠（免疫磁珠）法是近年发展迅速且被广泛应用的一种核酸提取方法，其优于传统方法的特点可以总结为以下几点：其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂；提取纯化的核酸质量好、产量高；提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化；这些优点使其有替代其它核酸提取和纯化方法的发展趋势。但在现有技术中，并未见有磁珠法用于提取纯化和检测CA16RNA的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于解决现有柯萨奇病毒A16型（CA16RNA）荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种RNA提取得率高、检测灵敏度高、检测范围宽而准确的CA16核酸荧光PCR检测试剂盒，可以对咽拭子、粪便等未知样本中的CA16RNA进行快速、准确检测，检测结果可用于CA16感染的辅助诊断。

本发明用磁珠法提取样本核酸，采用实时荧光定量PCR技术，以CA16基因组的高度保守区域为扩增靶目标，设计特异性引物及TaqMan探针，在实时荧光PCR仪上通过PCR扩增对CA16RNA进行定性检测。

本发明提供一种检测CA16RNA的方法，其中使用磁珠法提取和纯化CA16RNA。

在本发明中，所述磁珠是生物科学和纳米材料科学二者结合的产品。它运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠；该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。它利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能将血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的DNA和RNA分离出来，可应用于临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。在本发明中，所述磁珠可经商购获取。

在优选的情况下，本发明结合使用磁珠法和实时荧光PCR技术提取纯化和检测CA16RNA。