[发明专利]一种检测柯萨奇病毒A16型RNA的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种检测柯萨奇病毒A16型RNA的方法，其中使用磁珠法提取和纯化柯萨奇病毒A16型（CA16）RNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，结合使用磁珠法和实时荧光PCR技术提取纯化和检测CA16RNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤A，裂解病毒：每支离心管加入含磁珠的RNA提取溶液和待测样本，混匀后离心；CA16阴性对照和CA16阳性对照参照与待测样本相同的方法作RNA提取和纯化处理；

步骤B，磁珠吸附核酸：每管加入含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠的RNA提取溶液Ⅱ，混匀后静置；

步骤C，去除杂质：经离心后将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，再缓慢将溶液吸出；

步骤D，洗涤：每管加入含曲拉通和氯化钠的RNA提取溶液Ⅲ和含矿物油的RNA提取溶液Ⅳ，混匀后离心，将离心管再置于磁珠分离器上进行磁珠分离，静置分层后将液体吸出丢弃；

步骤E，RNA洗脱：加入含Tris-HCl和EDTA的RNA洗脱液将离心管壁上的磁珠洗脱到管底，混匀并静置后将离心管再次置于磁珠分离器上，然后将从磁珠上洗脱下来的RNA吸至新的灭菌离心管中；

步骤F，荧光PCR分析：将洗脱磁珠后的待测样本RNA、CA16阴性对照、CA16阳性对照中均加入含PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物、探针的PCR反应液和含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶的CA16酶混合液，在荧光定量PCR扩增仪上进行PCR反应，并分析结果。

4.一种检测CA16RNA的试剂盒，包括含磁珠的RNA提取溶液、和含用于靶多核苷酸扩增的上游引物CA16-F、下游引物CA16-R和用于靶多核苷酸检测的探针CA16-P的PCR反应液；其中，上游引物CA16-F的碱基序列为5′-GCCCTAGAGAAAAGGATGAACAACT-3′；下游引物CA16-R的碱基序列为5′-CAAGTGACTTGCCTGTTCCTGG-3；探针CA16-P的碱基序列为5’FAM-CATGCAGTTCAAGAGCAAACACCGTATTGA-BHQ13’。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括内标，即为一段长为88碱基对的人工合成DNA序列插入pUC18T载体的重组体，即质粒，其碱基序列为：5’-GCCAATACGACAAATCACCTTGGTCCTCTGTCATCCAGACTTCGCACGTCACGTATTCGAGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括如下组分，

①RNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠；

②RNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠；

③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化钠；

④RNA提取溶液Ⅳ：含矿物油；

⑤RNA洗脱液：含Tris-HCl和EDTA；

⑥内标：如上所述的可选择使用的内标；

⑦PCR反应液：包括5×PCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物CA16-F与CA16-R，用于靶多核苷酸检测的探针CA16-P，用于内标扩增和检测的上、下游引物IC-F与IC-R和探针IC-P；

⑧CA16酶混合液：含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶；

⑨CA16阳性对照：标定已知浓度的慢病毒，其浓度为1.00～5.00E+05copie/ml；

⑩CA16阴性对照：灭菌生理盐水。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在试剂盒中，

①RNA提取溶液Ⅰ：由十二烷基硫酸钠0.2～1.0%（质量/体积）、曲拉通1.0～4.0%（体积/体积），异硫氰酸胍0.2～1.0mol/L和100～400μg/ml的磁珠组成。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在试剂盒中，

②RNA提取溶液Ⅱ：包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸100～300mmol/L、氯化钠100～300mmol/L，溶液Ⅱ的pH值为6.5±0.2；

③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通0.1～1.0%（体积/体积）和氯化钠100～300mmol/L。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在试剂盒中，

⑤RNA洗脱液：含Tris-HCl 0.8～1.2mol/L和EDTA0.1～1.0mol/L；

⑦PCR反应液：包括5×PCR反应缓冲液10μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物CA16-F与CA16-R，0.2～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针CA16-P，0.1～0.2μmol/L的用于内标扩增的上、下游引物IC-F与IC-R，0.05～0.2μmol/L的用于内标检测的探针IC-P；

⑧C A16酶混合液：包括mMLV酶10～150U/μl和1～10U/μl的H-Taq DNA聚合酶。