[发明专利]一种固定化谷胱甘肽合成酶及其制备和应用

说明书

本发明涉及一种固定化谷胱甘肽合成酶及其制备和应用。具体地，将谷胱甘肽合成酶与载体进行固定化之后，得到稳定性和反应性大大提高的固定化谷胱甘肽合成酶；特别地，固定化载体与谷胱甘肽合成酶之间较长的连接元件可以获得特别好的固定化效果。本发明的固定化谷胱甘肽合成酶半衰期长，使得单位酶的生产力得到有效提高。用本发明的固定化谷胱甘肽合成酶作为GSH生物合成系统，生产过程简化、生产效率提高，简化了提纯工艺。

技术领域

本发明属于生物技术领域；具体地，本发明涉及一种固定化谷胱甘肽合成酶及其制备和应用。

背景技术

谷胱甘肽(简称GSH)，又名γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是一种广泛存在于动物、植物及微生物细胞内的一种小分子巯基化合物，具有维持胞内氧化还原平衡的功能。GSH重要的生理功能使其在医学、食品、化妆品等方面具有广泛的应用价值[Meister A andAnderson M.E.,Glutathione.Annu Rev Biochem,1983.52:p.711-760;Wu,G.,.Fang Y.Z,Yang S.,Lupton J.R.,and Turner N.D.Glutathione Metabolism and ItsImplications for Health.J.Nutr.,2004.134:p.489-492.]。

目前GSH的生产方法主要为化学合成法和生物法。虽然化学合成法和从富含胞内GSH的酵母细胞中提取GSH已实现工业化，但是两者都存在一定的不足之处。化学合成法较早应用于GSH的生产，但具有复杂、耗时等不足[吴坚平，林建平，岑沛霖.谷胱甘肽的生物合成.1999.]。GSH在生物体内是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH Ⅰ)和GSH合成酶(EC6.3.2.3，GSH Ⅱ)在ATP存在的条件下，催化L-谷氨酸，L-半胱氨酸和甘氨酸进行序贯反应合成。生物法生产谷胱甘肽主要包括酶转化法和发酵法两种方式，两者均通过利用细胞中的高活性酶系在温和的条件下实现GSH的合成；其最主要的区别则在于酶转化法需提供ATP，而发酵法则可利用细胞自身代谢，无需额外提供ATP。目前发酵法生产GSH的产量不高，且分离纯化工艺复杂，原料成本和能耗等成本都比较高；相对于发酵法，酶法反应时间短，反应简单，能够达到更高浓度和纯化收率等优点，是规模化生产GSH工艺研究的方向。

酶法合成GSH，高活性的谷胱甘肽合成酶是获得高浓度产物的关键之一。在已报道的谷胱甘肽合成酶中，除了上述常见的GSH Ⅰ和GSH Ⅱ，还发现了具有高活性的谷胱甘肽双功能合成酶，例如来源于无乳链球菌的谷胱甘肽双功能合成酶，以及来自嗜热链球菌的谷胱甘肽双功能酶，嗜热链球菌的谷胱甘肽双功能酶12h即可产生10.4g/L GSH，L-半胱氨酸的转化率达到85%。这些酶的发现，为酶法合成GSH的规模化生产提供了可能。

GSH的合成伴随着ATP的消耗(合成1M GSH需消耗2M ATP)，由于ATP价格昂贵，直接添加ATP显著增加了酶法合成GSH的成本，并且高浓度的ATP及其代谢产物ADP的存在还会强烈抑制GSH合成酶的活性，因此目前酶法生产GSH都采用ATP再生，主要采用酵母细胞再生的方式。目前酵母细胞再生ATP已发展到采用固定化酵母细胞再生的技术水平，从而实现再生系统的重复使用。这就为GSH合成酶的重复利用提出了相应的要求。

固定化酶（immobilized enzyme）是一种将酶固定于载体上的技术。一般地，经过固定化的酶本身还是溶于水的，只是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶的流动性降低。目前固定后的酶虽然稳定性增加，易从反应系统中分离，便于运输和贮存，但是活性降低（一般仅为游离酶的30%以下，甚至于仅为10%以下）。