[发明专利]利用获取光的多发色团检测和分析多核苷酸的方法和组合物

说明书

本申请是申请日为2003年6月20日的中国专利申请03819836.3“利用获取光的多发色团检测和分析多核苷酸的方法和组合物”的分案申请。

有关联邦资助研究的声明

为获得本发明所做的工作是国家卫生部的GM62958-01、国家科学基金会的DMR-0097611以及海军研究办公室的N00014-98-1-0759的基金资助下进行的。美国政府可在本发明中享有一定的权利。

技术领域

本发明涉及检测和分析样品中多核苷酸的方法、物品和组合物。

背景技术

可实现DNA序列实时检测且灵敏度高的方法具有重大的学术和经济利益。^1，2，3其应用包括医学诊断、遗传突变的鉴定、基因送递监控和特定基因组技术。⁴阳离子有机染料，如溴化乙锭和噻唑橙被插入双链DNA(ds DNA)的沟槽中，并充当直接DNA杂交探针时，便可激发，但缺乏序列特异性。^5，6用于链特异性测定的能量/电子转移发色团对是存在的，但需要化学标记两个核酸，或双重修饰相同的改变链(例如，分子信标)。^7，8标记两个DNA位点的困难导致了低产率、高成本，并生成了单个标记的杂质，从而使检测灵敏度较低。⁹

最近，有关肽核酸(PNAs)的介绍提供了新的研究和诊断应用方面的契机。^10，11在PNA中，DNA中带负电荷的磷酸键被肽模拟物中性酰胺键取代。与类似的DNA/DNA复合体相比，PNA/DNA复合体的形成更为快速，结合能更高，特异性也更高。¹²这些特性之所以被增强，是因为缺乏在带负电荷的DNA双链之间所存在的库伦排斥。PNA复合体具有更高的热稳定性，这是因为其主链对核酸酶、蛋白酶和肽酶生物降解的敏感性降低了。^13，14另外，PNA复合体在杂交期间对离子强度和pH通常不敏感，从而为DNA检测提供了更为宽广的平台。¹⁸

因此本领域需要检测和分析样品中特定多核苷酸的方法，以及在这些方法中有用的组合物和物品。

发明内容

本发明提供了用于检测和分析样品中目标多核苷酸的方法、组合物和物品。将怀疑含有目标多核苷酸的样品与聚阳离子多发色团和传感肽核酸(PNA)接触，其中传感肽核酸与目标多核苷酸互补。使传感PNA与信号传递发色团缀合。无需受理论约束，样品中存在目标多核苷酸时，认为通过利用与目标多核苷酸主链的静电相互作用，信号传递发色团被带入邻近阳离子多发色团的近程，其中目标多核苷酸已与传感PNA杂交(见图1)。随后，信号传递发色团可从已激发的聚阳离子多发色团获得能量，并发射可检测的光。目标多核苷酸天然存在于样品中时，可对其进行分析，或者可以在分析之前或分析的同时将其扩增。本发明提供了包含用于实现本发明方法的试剂的溶液，也提供了含有该试剂的试剂盒。本发明方法可用于多路设置，其中采用了多种不同传感PNA分析多种不同目标多核苷酸。本发明方法可任选在特定表面上进行，例如采用可与表面缔合的聚阳离子多发色团；该表面可以是传感器。本发明方法也可以均相形式被提供。检测多核苷酸的其它技术均可将此处所描述的方法和物品作为选择方案。

附图说明

图1表示了本发明方法，采用聚阳离子聚合物作为获取光的多发色团。提供了传感PNA(PNA-C*)，包含信号传递发色团，并具有与所关心目标多核苷酸互补的碱基序列。在与样品中目标多核苷酸接触时，由于与目标多核苷酸存在静电相互作用，聚阳离子多发色团被带入邻近信号传递发色团的近程。随后，多发色团的激发使信号传递发色团发射光。

图2所示分别为聚合物1(见下文)和传感肽核酸PNA-C*的吸收(绿色和橙色)和发射(蓝色和红色)光谱。对聚合物1和PNA-C*的激发分别在380和480nm处进行。

图3所示为通过聚合物1的激发，在互补(红色)和非互补(黑色)DNA存在条件下的PNA-C*发射光谱。将PNA-C*和相应的DNA一起加入pH＝5.5的水中。该光谱相对于聚合物1的发射被标准化。

图4所示为通过寡聚体2的激发，在互补(红色)和非互补(黑色)DNA存在条件下的PNA-C*发射光谱。将PNA-C*和相应的DNA一起加入pH＝5.5的水中。该光谱相对于寡聚物2的发射被标准化。

具体实施方式