[发明专利]一种鉴定辣椒疫霉CesA3基因核苷酸点突变及其对CAA类杀菌剂抗药性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及辣椒疫霉纤维素合酶相关基因CesA3的克隆及其在CAAs杀菌剂抗性监测中的应用，具体公开一种快速鉴定辣椒疫霉CesA3基因的核苷酸点突变及其对CAA类杀菌剂抗药性的分子检测方法及专用引物。属于分子生物学技术领域。

背景技术

辣椒疫病是一种世界性的重要病害,该病于1918年首次在美国被发现，现已遍及世界各地的辣椒种植区。辣椒疫病的病原是辣椒疫霉（Phytophthora capsici Leonian），为二倍体、丝状、异宗配合的卵菌。辣椒疫霉的寄主范围很广，可侵染茄科、葫芦科、豆科及松科50多种植物。世界五大洲均有辣椒疫霉引起植物病害发生的报道。辣椒疫霉可以危害辣椒的根、茎、叶和果实等部位。由于辣椒疫病是多循环的病害,在一个生长季可以发生多次接种体的产生和侵染循环，因此在气候条件适宜的情况下，短期内就可暴发，蔓延速度极快，使辣椒生产遭受严重的经济损失。并且随着病害的扩展蔓延和研究工作的深入，越来越多的地区发现辣椒疫霉的分布，并且其两种交配型在多数地区同时存在。有性生殖的发生使得田间辣椒疫霉菌株的遗传多样性越来越丰富，给病害的防治带来很多困难。

虽然根据辣椒疫霉引起植物病害的发生流行特点，控制水分和湿度可以有效降低病害的严重度，然而在特定的地理环境和土壤条件下，农业防治措施不一定能够及时实施并有效控制辣椒疫霉引起的病害的发生，所以化学防治仍然是防治辣椒疫霉引起的植物病害的最重要措施。但是专门用于卵菌病害防治的杀菌剂种类较少，最具有代表性的是以甲霜灵为代表的苯酰胺类杀菌剂，是第一代专门用于防治卵菌病害的一大类重要的内吸性杀菌剂。然而，随着该类杀菌剂的广泛使用，有关甲霜灵类杀菌剂的抗性报道越来越多，抗性群体在田间所占的比例越来越高，并导致对苯酰胺类杀菌剂的抗性成为辣椒疫霉化学防治中最主要的问题。在此背景下另外一大类可用于辣椒疫霉引起病害的内吸性高效杀菌剂—羧酸酰胺类杀菌剂（CAA类杀菌剂）应运而生，并成为生产上防治疫病和霜霉病的主要杀菌剂类别，主要包括烯酰吗啉(dimethomorph)、氟吗啉(flumorph)、异丙菌胺(iprovalicarb)和双炔酰菌胺(mandipropamid)等（FRAC网站，http://www.frac.info/frac/index.htm）。CAA类杀菌剂作用机制的研究结果表明，与纤维素合成相关的蛋白酶cesA3是CAA类杀菌剂的作用靶标（朱书生等，2007；Blum et al.,2010）。辣椒疫霉对CAAs杀菌剂的抗性机制目前还未明确，明确其具体的抗性基因及抗性检测方法，可以对抗性菌株进行早期检测，了解其抗性发展动态，制定合理的病害管理方案，延缓抗药性的产生。

虽然从20世纪90年代末开始使用CAA类杀菌剂防治辣椒疫霉，但田间抗药性菌株发现的报道很少。然而在室内条件下通过自然培养获得了对CAA类杀菌剂产生高抗性水平的辣椒疫霉菌株，并且抗性菌株的生存适合度较高，推测随着CAA类杀菌剂在防治辣椒疫霉中的大量使用，田间有可能产生抗性菌株，并带来较高的抗性风险。

植物病原菌抗药性检测方法包括普通生物学方法和分子生物学方法。普通生物学方法需要通过测定药剂对病原菌的EC₅₀来比较敏感和抗性菌株的差异，试验需要多个处理，多次重复，因此检测周期长、工作量大、消耗的人力资源和材料较多。而且上述常规方法检测灵敏度低，抗药性菌株的突变频率在1%以上才能被检测到。而分子生物学方法，检测所需时间短、检测的灵敏度高，检测频率在10^-5~10^-4，更适用于检测低频率的抗药性基因，因此也被作为田间抗药性早期诊断的理想方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的方法及其专用引物对。

本发明所提供的检测或辅助检测辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测辣椒疫霉的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为302bp的片段，则所述待测辣椒疫霉中CesA3基因存在或候选存在突变位点；

所述突变位点指辣椒疫霉中CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3450位核苷酸为C。