[发明专利]一种兔瘟组织灭活疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对抗兔瘟的组织灭活疫苗，同时还涉及一种该兔瘟组织灭活疫苗的制备方法，属于兽用动物疫苗领域。

背景技术

兔病毒性出血症（RHD）俗称“兔瘟”，或称兔出血症，是由兔病毒性出血症病毒（RHDV）引起的兔的一种急性、高度接触性传染病，特征为病死兔出现全身败血症变化，各脏器都有不同程度的出血、充血和水肿。肺高度水肿，有大小不等的出血斑点，切面流出多量红色泡沫状液体。喉头、气管粘膜淤血或弥漫性出血，以气管环最明显；肝脏肿胀变性，呈土黄色，或淤血呈紫红色，有出血斑；肾肿大呈紫红色，常与淡色变性区相杂而呈花斑状，有的见有针尖状出血；脑和脑膜血管淤血，脑下垂体和松果体有血凝块；胸腺出血。3月龄以上的青年兔和成年兔发病率和死亡率最高（可高达95％以上），断奶幼兔有一定的抵抗力，哺乳期仔兔基本不发病。可通过呼吸道、消化道、皮肤等多种途径传染，潜伏期48～72小时。本病常呈暴发性流行，发病率及病死率极高，对易感兔致病率达90%，病死率高达100%，是危害养兔业的最严重的疾病之一。

对RHDV感染至今尚无有效治疗药物，所能应用的治疗措施仅限于对症治疗和支持治疗，且防治本病经治疗后效果极差，抗生素、磺胺类药物仅防止并发症。当前我国控制该病主要依靠兔瘟疫苗的免疫接种。尽管疫苗的使用已相当普及，由于某些原因，我国每年还有许多兔群发生兔瘟，给养兔场造成一定的经济损失。因此研制安全有效的兔瘟疫苗，称为预防控制该病流行的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫活性较强的兔瘟组织灭活疫苗。

同时，本发明的目的还在于提供一种兔瘟组织灭活疫苗的制备方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种兔瘟组织灭活疫苗，包含有兔瘟组织病毒液和蜂胶佐剂，加入比例为：每毫升病毒提取液中含有5-15mg蜂胶。

所述的兔瘟组织病毒液来源于发病兔瘟肝脏组织，取适量按1：5（v/v）加入无菌生理盐水研磨处理离心后取上清液保存。

所述的蜂胶佐剂可以采用如下方法制备：市场直接购买的蜂胶在-4℃进性冷冻处理6h，冷冻后的蜂胶用粉碎机粉碎，过20目筛，用950g/L酒精纯化，并配成30mg/ml的蜂胶溶液。

同时，本发明的技术方案还采用了一种兔瘟组织灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：（1）兔瘟组织病毒液获得；（2）成品疫苗配置：取合格蜂胶研磨，用950g/L酒精纯化，并配成30mg/ml的溶液，得到制苗用蜂胶佐剂；（3）取步骤（1）所得的灭活病毒液与蜂胶佐剂，用胶体磨乳化，加入10mg/l硫柳汞，使其最终浓度达0.01%，混合均匀，定量分装；分装每只注射1ml，按20ml/瓶或40ml/瓶分装；检验合格的疫苗采用皮下注射，每只注射1ml。

所述的兔瘟组织病毒液获得具体包括以下步骤：

（1）病料来源及处理剖检有典型兔瘟症状的病死兔，无菌取肝脏组织研磨后按照1：5加入无菌生理盐水，再加上青链霉素1000U（ug）/ml,放置4℃过夜，反复冻融3次4000rpm/min离心5分钟，取上清于4℃12000rpm/min20分钟离心纯化后，无菌取其上清液保存备用；

（2）兔体传代培养取上述备用组织上清液以1ml/只注射小鼠，共5只，每传一代均取死亡兔肝脏保存于-15℃低温下，作为传代材料；

（3）病毒液获取将收集肝脏取少许按1：5加入无菌生理盐水，研细，1500rpm/min离心10分钟，取上清，做无菌试验和凝集人O型红细胞实验，无菌条件下，将剩余肝脏除去脂肪和结缔组织，剪碎后用捣碎机反复捣碎3000rpm/min，5min，六层纱布过滤，收集滤液，用pH为7.2的PBS液10倍稀释；

（4）毒液灭活在步骤(3)的PBS稀释液中加入试剂纯福尔马林液，使其最终含量为0.4%，充分摇匀，用玻塞盖口再用溶蜡密封。置于37℃环境中作用48小时，每2小时振摇一次，使其充分灭活，制成灭活疫苗，低温保存。

用无菌生理盐水稀释研磨后的组织悬液用4000rpm/min离心5分钟，取上清于4℃10000rpm/min30分钟离心纯化后，无菌取其上清液保存备用。

处理的肝脏病料进行了传代培养，取上述备用组织上清液以1ml/只注射小鼠，共5只，每传一代均取死亡兔肝脏保存于-15℃低温下，作为传代材料；共传四代，用兔20只，发病19只，接种后三天内死亡17只，收集病死兔肝脏低温保存；证实无菌且血凝试验阳性时判为合格。

低温保存为-15℃，血凝试验凝集对象为人O型1%红细胞，阳性效价HA为2⁷。