[发明专利]一种兔瘟组织灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种兔瘟组织灭活疫苗，其特征在于：包含有兔瘟组织病毒液和蜂胶佐剂，加入比例为：每毫升病毒提取液中含有5—15mg蜂胶。

2.根据权利要求1所述的兔瘟组织灭活疫苗，其特征在于：所述的兔瘟组织病毒液来源于发病兔瘟肝脏组织，取适量按1：5（v/v）加入无菌生理盐水研磨处理离心后取上清液保存。

3.根据权利要求1所述的兔瘟组织灭活疫苗，其特征在于：所述的蜂胶佐剂可以采用如下方法制备：市场直接购买的蜂胶在-4℃进性冷冻处理6h，冷冻后的蜂胶用粉碎机粉碎，过20目筛，用950g/L酒精纯化，并配成30mg/ml的蜂胶溶液。

4.一种如权利要求1所述兔瘟组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）兔瘟组织病毒液获得；（2）成品疫苗配置：取合格蜂胶研磨，用950g/L酒精纯化，并配成30mg/ml的溶液，得到制苗用蜂胶佐剂；（3）取步骤（1）所得的灭活病毒液与蜂胶佐剂，用胶体磨乳化，加入10mg/l硫柳汞，使其最终浓度达0.01%，混合均匀，定量分装。

5.根据权利要求4所述的兔瘟组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的兔瘟组织病毒液获得具体包括以下步骤：

（1）病料来源及处理剖检有典型兔瘟症状的病死兔，无菌取肝脏组织研磨后按照1：5加入无菌生理盐水，再加上青链霉素1000U（ug）/ml,放置4℃过夜，反复冻融3次4000rpm/min离心5分钟，取上清于4℃12000rpm/min20分钟离心纯化后，无菌取其上清液保存备用；

（2）兔体传代培养取上述备用组织上清液以1ml/只注射小鼠，共5只，每传一代均取死亡兔肝脏保存于-15℃低温下，作为传代材料；

（3）病毒液获取将收集肝脏取少许按1：5加入无菌生理盐水，研细，1500rpm/min离心10分钟，取上清，做无菌试验和凝集人O型红细胞实验，无菌条件下，将剩余肝脏除去脂肪和结缔组织，剪碎后用捣碎机反复捣碎3000rpm/min，5min，六层纱布过滤，收集滤液，用pH为7.2的PBS液10倍稀释；

（4）毒液灭活在步骤(3)的PBS稀释液中加入试剂纯福尔马林液，使其最终含量为0.4%，充分摇匀，用玻塞盖口再用溶蜡密封。置于37℃环境中作用48小时，每2小时振摇一次，使其充分灭活，制成灭活疫苗，低温保存。

6.根据权利要求5所述的兔瘟组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于：用无菌生理盐水稀释研磨后的组织悬液用4000rpm/min离心5分钟，取上清于4℃10000rpm/min30分钟离心纯化后，无菌取其上清液保存备用。

7.根据权利要求5所述的兔瘟组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于：处理的肝脏病料进行了传代培养，取上述备用组织上清液以1ml/只注射小鼠，共5只，每传一代均取死亡兔肝脏保存于-15℃低温下，作为传代材料；共传四代，用兔20只，发病19只，接种后三天内死亡17只，收集病死兔肝脏低温保存；证实无菌且血凝试验阳性时判为合格。

8.根据权利要求5所述的兔瘟组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于：低温保存为-15℃，血凝试验凝集对象为人O型1%红细胞，阳性效价HA为2⁷。

9.根据权利要求7所述的兔瘟组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于：阳性冰冻保存液用甲醛灭活，最终含量为0.4%，充分摇匀，用玻塞盖口再用溶蜡密封，置于37℃环境中作用48小时，每2小时振摇一次，使其充分灭活。