[发明专利]人类唐氏综合症DNA序列在检测植入鼠体内的人细胞数量中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及人类唐氏综合症DNA序列在作为检测植入鼠体内的人细胞数量的靶标序列的应用，以及人类唐氏综合症DNA序列在检测植入鼠体内的人细胞数量的方法和基于此方法的试剂盒中的应用。

背景技术

鼠（包括大鼠和小鼠）是常用的生物医学实验动物，广泛地用于人癌细胞转移和人干细胞移植治疗的实验研究。实验中需注射一定数量的人细胞到鼠体内，准确掌握这些细胞在鼠体内的分布对于研究细胞的特性及判断药物治疗效果都非常重要，但长期缺少一种灵敏、稳定的方法，确定这些人癌细胞或干细胞在植入鼠体内后在各器官的分布情况。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，基于PCR的技术已广泛应用于生物检测和疾病诊断等领域。

虽然既往也有基于PCR技术的检测属组织中人细胞的方法，但存在方法复杂、可重复性差、特异性低等缺陷。

发明内容

本发明的一个目的是提供人类唐氏综合症DNA序列在作为检测植入鼠体内的人细胞数量的靶标序列的应用。

基于上述应用，本发明还提供人类唐氏综合症DNA序列在检测植入鼠体内的人细胞数量的方法和基于此方法的试剂盒中的应用。

本发明所提供的检测植入鼠体内的人细胞数量的方法，是提取植入人细胞的鼠的基因组基因，将人类唐氏综合症DNA序列片段作为靶标序列，利用权利要求3或4所述的引物对进行PCR扩增，测定Ct值，根据Ct值和每个细胞含有的基因组基因的量，推算植入的人细胞数量。

所述PCR扩增采用的realtime PCR方法。上述鼠为大鼠或小鼠。

基于上述方法的试剂盒，包括扩增人类唐氏综合症DNA序列的引物，所述引物优选为核苷酸序列为序列表中序列1和序列2所示的寡核苷酸组成的引物对。

上述引物对也属于本发明的保护范围。

利用上述引物对，就可以采用realtime PCR方法建立在鼠组织中定量检测人细胞数量的方法，用于检测人癌细胞在鼠组织中的转移和干细胞在鼠组织中移植的动物实验研究，该方法具体包括：

（1）提取实验鼠组织的基因组DNA；

（2）使用本发明的试剂盒，用Real-Time PCR法检测其中人DNA含量；

发明人在长期的研究工作中发现唐氏综合症可能是灵长类特有的序列,作为噬鼠类的大鼠和小鼠并不具有相应的同源序列,基于此,我们用人第21对染色体上人类所特有的唐氏综合症序列Human Down Syndrome region of chromosome 21,clone A37A2-1F8.ACCESSION:U50569)对大鼠和小鼠基因组序列进行Blast,Blast的结果表明,唐氏综合症序列对大鼠和小鼠的基因组序列具有极大的特异性,是理想的检测植入鼠体内的人细胞数量的靶标序列,具有应用前景。

基于此发现,并达到真正的实用目的,我们在人第21对染色体上人类所特有的唐氏综合症序列(Human Down Syndrome region of chromosome 21,clone A37A2-1F8.ACCESSION:U50569)上设计出一系列real-time PCR引物,分别用这些引物序列对小鼠基因组序列进行Blast,分析这些引物序列与小鼠基因组序列的同源性,从其中选出一对特异性最好的引物(其序列为：上游引物（Ｆ）：5′－TTGATCCTGAGCGCGTGTTAG－3′（序列表中序列1）；下游引物（Ｒ）：5′－TGGCCAGAGCAGACATTCAAG－3′（序列表中序列2）))。PCR反应中，引物设计的好坏直接影响检测的特异性和灵敏度,由于这一对引物特异性好的原因,可以在200ng鼠DNA中用real-time PCR方法定量检测出低至5pg的人DNA,建立了在鼠DNA中检测微量人DNA水平的real-time PCR方法,为研究人类干细胞注入鼠尾静脉后在鼠体内各器官分布奠定了坚实的方法学基础。此real-time PCR引物和方法,可以广泛地用于检测人癌细胞或人干细胞在鼠体内各器官的分布,在肿瘤学和干细胞在体治疗的研究中有广泛的应用前景。

实验结果证明，以上述引物为主要试剂的试剂盒灵敏度高，重复性好，是一种简单、可靠的检测植入鼠体内的人细胞在各脏器分布情况的方法，在肿瘤学和干细胞研究中有广阔的应用前景。上述试剂盒可以从鼠组织或体液中检测人细胞，具有使用特异性引物，具有特异性高、敏感性强、重复性好之优点。