[发明专利]动物疫病三色荧光RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的荧光PCR试剂盒，尤其是涉及用于禽流感、新城疫病毒野毒及禽传染性支气管炎病毒野毒的三色荧光RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

禽流感与新城疫同属国际兽医局指定的A类烈性禽类传染病，具有传播快、发病急、死亡率高的特征，在国家动物防疫法上同被列为一类动物疫病。禽传染性支气管炎是由一种冠状病毒引起的仅发生于禽的急性、高度接触性呼吸道疾病。禽流感（记为AIV）、新城疫（记为NDV）及禽传染性支气管炎（记为AIBV）的症状相似、病理进程难以区分，而社会危害相差悬殊：目前对这三种疫病采取的控制及扑杀的规定不同，禽流感特别是高致病性禽流感如H5N1、H7等可以突破种群传播的界限，能够导致易感人群发病，具有极高的致死率；而新城疫及禽传染性支气管炎属于严格的禽类传染病，一般对人不致病。所以一旦误诊误判，后果将不堪想象。禽流感病毒属于正粘病毒科甲型流感病毒属（基因组分为节段的RNA，容易发生重排）；新城疫病毒是副粘病毒科（基因组为单股不分节的RNA）；而禽传染性支气管炎病毒是冠状病毒科冠状病毒属（基因组为单股不分节段的RNA），因此，可以借助基因诊断等分子生物学手段进行快速准确的鉴别诊断。

目前世界动物卫生组织规定对禽流感、新城疫病毒的检验检疫方法包括：病毒的分离鉴定、琼脂凝胶免疫扩散试验、血凝和血凝抑制试验等。而禽传染性支气管炎病毒也是按照上述方法进行检测。

病毒的分离与鉴定：首先将样品接种至无特定病原的禽胚，病毒会随着禽胚的发育而增殖，经一星期后抽取禽胚的尿囊液，进行血凝和血凝抑制试验，从而可以判定检测样本中是否含有病毒。该方法的优点是灵敏度高，但是周期长，约需21天，而且工作量大，需要大量的人力物力。

琼脂凝胶免疫扩散实验：最早由oudin于1946年进行对抗原混合物进行分析。基本原理是在一定孔径的凝胶中，当抗原与抗体分子相遇时，形成抗原抗体复合物，若两者比例适当，则复合物分子量增大，颗粒增大，不再继续扩散而产生沉淀线。不同的抗原所形成的沉淀有各自的位置，从而可以将抗原分开。该方法的优点是简单易行，不需要特殊仪器，但是由于抗体分子与抗原决定簇的结合并不是一一对应的，而且，由于离子强度、PH等因素，致使该方法的特异性较低。

血凝和血凝抑制试验：其基本原理是某些病毒或者病毒的血凝素，能选择性的使几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝。当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，成为血凝抑制反应。该方法的优点是快速简单，但是由于他检测的是病毒抗体，而抗体必须在感染后相当一段时间内才能产生，因此，该方法的应用范围受到限制。

随着分子生物学的飞速发展，对禽流感、新城疫及禽传染性支气管炎病毒的检测手段也有了快速的发展。例如采用逆转录聚合酶链式反应和实时荧光逆转录聚合酶链式反应。而普通的RT-PCR试验其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作繁琐。而三色荧光PCR技术原理是基于单色荧光PCR技术，是指在同一个荧光PCR扩增试验中同时扩增四个目的基因，探针为多种荧光标记比如FAM、VIC、ROX、NED、HEX等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。由于该方法引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高且容易漏检的问题。但是，目前国内外还没有关于对禽流感、新城疫及禽传染性支气管炎进行同步检测的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够同时在同一反应管中实现样本中禽流感、新城疫及禽传染性支气管炎病毒检测的特异性强、灵敏度高、快速准确的动物疫病三色荧光RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

本发明为实现上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种动物疫病三色荧光RT-PCR检测试剂盒，是在对禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽传染性支气管炎病毒野毒核酸序列分析的基础上，通过生物信息学方法分析选取保守基因序列设计出特异性引物，利用荧光PCR技术对禽流感、新城疫病毒野毒及禽传染性支气管炎病毒野毒进行检测。此技术不仅能够对禽流感病毒快速、准确及特异的定性检测，还能够有效区分新城疫病毒野毒与疫苗毒、禽传染性支气管炎病毒野毒与疫苗毒。