本发明提供一种大正三色与昭和三色锦鲤性别特异DNA标记及其应用,所述的DNA标记,其中雄鱼的DNA标记片段的核酸序列为SEQ ID NO:1;雌鱼的DNA标记片段的核酸序列为SEQ ID NO:2。本发明还提供一种鉴定大正三色与昭和三色锦鲤遗传性别的方法,是通过检测性别特异DNA标记存在与否来确定待检测的锦鲤的性别。本发明检测大正三色与昭和三色锦鲤遗传性别的方法,对大正三色与昭和三色锦鲤亲鱼繁育、家系建立及控制养殖群体的雌雄性别比例,推动大正三色与昭和三色锦鲤养殖业可持续健康发展具有重要意义和应用价值。