[发明专利]一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及核酸酶检测技术领域，特别是指一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒。

背景技术

非特异性核酸内切酶(Non-specific Endonuclease，NE)作用是把核糖核酸(包括DNA、RNA)降解成小的核酸片段和核苷酸，在生物制品行业中有广泛的应用。尤其在医药用生物制品如病毒性疫苗和基因工程蛋白产品中，是降低宿主细胞核酸残留的重要方法，而非特异性核酸内切酶本身的去除是高质量产品生产中的必须步骤，检测其残留也是产品质量评价中的重要一环。非特异性核酸内切酶(NE)属于磷酸二酯酶系列，能水解核酸(包括DNA、RNA)中非特定位点的的3’-5’磷酸二酯键，产物是3’核苷酸或寡核苷酸。常用的是来自于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocal aureus)的非特异性核酸内切酶，以及核酸酶P1(来自于桔青霉，Penicillium citrinum)等。非特异性核酸内切酶在工业中应用主要为1、(脱氧)核苷酸生产；2、生物制品中核酸残留的去除；前者应用中核酸降解获得的5’一核苷酸和5’一脱氧核苷酸可加工成各种医用药品、生化试剂、助鲜剂以及农作物促生长剂，它广泛应用于生物工程、医药、食品、化妆品、农业生产和科研等领域，并具有很高的经济价值。在生物制品中宿主细胞的核酸残留控制是纯化工艺的难点，尤其是病毒性疫苗抗原的生产中很难去除。采用非特异性核酸内切酶是去除残留核酸的有效方法。

目前采用的方法为两类：1、定性检测方法，主要是通过在一定的反应体系中加入NE和鲑鱼精DNA，反应在预定时间中止，设定阴性对照和阳性对照。然后用琼脂糖电泳观察DNA的片段分布，通常阳性样本中根据酶活性不同，鲑鱼精DNA会降解成在200bp～数kbp范围的涂抹条带，或约100～200bp大小的片段，或者基本降解后没有可见条带。该方法的优点是直观、可靠，可以知道底物的水解程度，缺点是无法对酶活性进行定量分析；2定量检测方法，典型的定量检测方法，是通过在一定的反应体系中加入NE和鲑鱼精DNA，反应在预定时间加酸(高氯酸)中止，设定阴性对照和阳性对照。然后高速离心(12000×g)沉淀酸不可溶的DNA，以UV分析A_260nm，通常1OD相当于1个单位。该方法是NE类酶活性定义的基本方法，其缺点是不能进行微量分析，必须事先知道所分析的酶种类。分析时间较长，通常为2～4h。

发明内容

鉴于以上现有技术中存在的问题，本发明提出一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，解决了现有技术中无法同时对酶活性进行定量和微量分析的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，该试剂盒包括：

NE反应体系和荧光探针；

或NE反应体系和荧光染料。

作为优选的技术方案，所述的试剂盒还包括连续记录荧光信号的仪器。

作为优选的技术方案，所述的试剂盒还包括定量PCR仪或荧光检测仪。

作为优选的技术方案，所述的NE反应体系为通用反应缓冲液或系列反应缓冲液；所述的通用反应缓冲液是可同时应用于各酶的溶液，其成分包括Tris·HCl，浓度为10-100mM，优选为20-50mM；pH范围为5～9.5，优选为5.4～8.5；还含有Ca²⁺、Zn²⁺或Mg²⁺，浓度为1mM-20mM，优选为2-10mM；如果采用荧光染料，需事先加入DNA标准品，如鲑鱼精DNA或合成的随机引物，用量为1-500ng/μl；所述系列反应缓冲液指分别针对单一酶设计的缓冲液组分，每组2-5种，其区别在于设计不同的pH值，使同一样品在不同pH值下测定活性比，对照标准品获得酶种类信息。

作为优选的技术方案，所述的荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团；探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；NE反应时，酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每切开一个探针链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与酶作用产物形成同步。