[发明专利]一种改进的海带染色体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及染色体的制备方法，尤其涉及改进的海带染色体的制备方法。

背景技术

海带的孢子体个体大，是人工栽培的对象。海带配子体为微小的丝状体，是人工培育苗种的对象，也是海带种质资源保存的基础。海带配子体有雌雄之分，雌配子体由一个或几个细胞组成，雄配子体一般由多个细胞组成，雄配子体细胞较雌配子体细胞个体小。在成长过程中，雌配子体增加细胞的体积，而雄配子体则进行细胞的分裂，增加细胞的数目，形成多细胞的分枝体或团在一起的球状体。

海带染色体较小，由于染色体制备方法的不同，致使海带染色体数目存在争议。在早期主要是用切片法和铁苏木精染色。切片法是比较原始的方法，用于计算染色体费时且不精确。随后多用压片法和醋酸洋红、水合氯醛醋酸铁苏木精或醋酸地衣红染色。二十世纪六七十年代国内外学者对海带配子体细胞通过压片法观察染色体数目，多数学者认为只有22条，少数学者认为有31条。到二十世纪九十年代，日本学者Hiroshi Yabu等认为海带配子细胞约有32条染色体(见论文“四种海带(褐藻)的染色体数目”，《日本藻类学杂志》，1991年第39卷第2期，第185-187页)。2004年中国学者周立然等利用压片及苏木精染色观察到海带配子体具有31条染色体。压片法得到的染色体多呈点状，无法鉴别染色体形态，不能作核型分析(见论文“一种改进的海带雄配子体(不等鞭毛类)染色体制备方法”，《水生生物学》，2004年第512期，第141-144页)。刘宇等学者(见论文“海带染色体的DAPI染色及核型初步分析”，刊登在《水产学报》2012年第01期，第50-54页)利用滴片法及DAPI荧光染料染色的方法，观察到海带配子体细胞具有31条染色体，染色体分散较好，数目形态可辨。但使用荧光染料染色只能通过荧光显微镜才能观察结果，荧光显微镜市场销售价位较高，不能普及使用。

发明内容

本发明提供一种染色体分散好，形态可辨且可数的改进的海带染色体的制备方法。

本发明的技术解决方案是：

一种改进的海带染色体的制备方法，其步骤是：

(1)海带配子体预处理：海带配子体离心后吸除多余水分保留海带配子体沉淀，并加入秋水仙素溶液振荡摇匀静置；

(2)海带配子体低渗：海带配子体用氯化钾溶液低渗；

(3)海带配子体固定：低渗后的海带配子体用卡诺固定液进行固定；

(4)酶解去壁：用纤维素酶R-10溶液、果胶酶溶液、离析酶R-10溶液的混合酶液进行酶解去壁。

(5)冷滴片：酶解去壁后的海带配子体离心后用移液枪吸除上清液，加入冰乙酸，振荡混匀成细胞悬液，用滴管吸取细胞悬液在离预冷的载玻片的上面滴片，载玻片底面经过酒精灯火焰烧一次后自然晾干或烘干；

(6)姬姆萨染色：对附着在载玻片上的海带配子体染色体采用姬姆萨染色液进行染色。

(7)显微镜下观察和拍照。

上述步骤(1)的秋水仙素溶液为重量体积比为0.2％的秋水仙素溶液，海带配子体加入0.2％的秋水仙素溶液后于4℃下静置7～8小时。

上述步骤(2)的氯化钾溶液的浓度为0.075mol/L，海带配子体沉淀加入浓度为0.075mol/L的氯化钾溶液后振荡摇匀，在室温下静置30～40分钟。

上述步骤(3)的卡诺固定液是由甲醇和冰乙酸按3∶1的体积比配置，卡诺固定液4℃下固定三次，每次20分钟，最后再换新的卡诺固定液4℃下固定24小时。

上述步骤(4)中，纤维素酶R-10溶液、果胶酶溶液、离析酶R-10溶液按2∶1∶1的体积比混合摇匀后成为混合酶液，现配现用，4℃下放置。

上述步骤(5)中，离预冷的载玻片30～40厘米的高度进行滴片。

本发明的技术效果是：本发明采用冷滴片及吉姆萨染色的方法，得到了染色体分散较好，形态可辨且可数的染色体分裂相。同时姬姆萨染色是对整条染色体染色，不会出现淡染区域，且使用普通显微镜即可观察结果。本发明方法采用冷滴片及姬姆萨染色的方法，得到了染色体分散较好，形态可辨且可数的染色体分裂相。另外，本发明方法简便快速，可重复性强，一般实验室均可以操作。

附图说明

1、图1为本发明方法制备的东方2号杂交海带配子体染色体照片。

2、图2为中国学者周立然利用压片法及苏木精染色的海带配子体染色体照片。

3、图3为姬姆萨染色载玻片搭桥俯视图。

4、图4为姬姆萨染色载玻片搭桥侧视图。