[发明专利]一种检测Leber病调控子的试剂盒及用途

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种与Leber病调控子相关的线粒体基因突变的检测方法，特别涉及检测线粒体tRNA^Met A4435G突变的方法，还涉及用于检测与Leber病调控子相关的线粒体DNA A4435G突变的试剂盒，以及上述方法或上述的试剂盒在检测与Leber病调控子相关的线粒体DNA A4435G突变中的应用。

背景技术

Leber遗传性视神经病变（Leber's Hereditary Optic Neuropathy，LHON，简称Leber病）是视神经病变的一种类型，主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维，导致视神经退行性变的母系遗传病，严重的影响着人们正常的生产、生活。根据国家卫生部（http://www.moh.gov.cn/）最新数据统计我国现有的低视力人口约有710万，盲人约有500万，占总人数的0.4%，成为世界上视力损伤最严重的国家之一。其中，由视神经病变引起的约为55万。1871年德国眼科医生Theodor Leber首次报道该病的临床症状、体征和遗传特性。1972年Erickson等发现LHON的遗传方式呈典型的母系遗传特征。1988年Wallace DC等发现了第一个与LHON相关的线粒体基因组DNA（mitochondria DNA, mtDNA）突变位点ND4 G11778A。目前已报道50多种线粒体DNA突变位点与LHON致病相关(http://www.mitomap.org/)，其中tRNA^Met A4435G和tRNA^Thr A15951G等被称为“Leber病调控子”。

与线粒体DNA突变相关的Leber遗传性视神经病变在早期临床症状不明显，早期的检查常常会因此被耽误，尤其在我国偏远农村地区，这种情况普遍存在。因此，在高危人群和易感人群中开展mtDNA突变筛查，对于预防和控制与线粒体相关的LHON的发生有着极其重要的作用。

自发现与mtDNA突变相关的疾病以来，检测线粒体突变位点的检测方法主要还是序列测定。直接测序法是鉴定突变的黄金标准，但该操作繁琐，费用昂贵限制了它的广泛应用。

近年来，国内相继报道了Leber遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测方法，以满足对线粒体突变突变进行广泛筛查的需要，如福建医科大学于2005年申请了的基因诊断试剂盒及其检测方法专利（专利号：200510006097.8），该发明是根据90％以上的Leber氏遗传性视神经病变患者的线粒体DNA突变属于３个原发性致病位点突变（G11778A、G3460A和T14484C），设计和合成位点特异性PCR引物，直接以全血样作PCR的DNA模板，利用等位基因特异性多重PCR技术，单管一次性PCR反应，同时检测LHON患者的线粒体DNA的３个原发性致病突变位点，具有简便快速、高效、费用低、特异性好、只需微量血液样本等优点，为LHON患者的快速临床基因诊断提供一种简易、可靠的方法和试剂盒，具有巨大的普及推广应用价值。但是该方法存在血液中直接PCR扩增的难度加大，实验中采取的多重PCR的条件要求将会增加，检测方法跟普通的方法没有本质的区别。2006年杭州优思达生物科技有限公司建立一种以单核苷酸多态性核酸试纸快速检测LHON线粒体DNA 中G11778A 位点突变的新方法（专利号：200610003429. 1）。在应用单核苷酸多态性核酸检测试纸条进行多态位点或突变位点的检测时,需要设计一条特异性延伸引物，这条引物的3’端碱基紧临多态性碱基或突变碱基,其在DNA聚合酶的作用下开始延伸,带有抗原标记与模板对应的双脱氧单核苷酸(ddNTP) 被连接到延伸引物上。虽然该方法能够实现短时间内的检测阳性位点，但PCR扩增条件严格，存在假阴性的几率大大增加。

发明内容