[发明专利]一种检测Leber病调控子的试剂盒及用途

权利要求书

1.一种检测Leber病调控子相关的线粒体DNA突变的试剂盒，由引物序列、提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标本对照、阴性标本对照以及使用说明书构成；其中，提取样本基因组DNA的试剂由细胞裂解液和主要成分是蛋白酶K的溶液Ⅰ组成；PCR扩增反应试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、MgCl₂、三蒸Taq水和酶；引物序列是：外前向引物F: TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA，外反向引物R: AAG GAT TAT GGA TGC GGT TG；内前向引物F: CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT，内反向引物R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC；限制性内切酶包括限制性内切酶NlaⅢ；阳性标本对照是含有线粒体序列第4435位点发生A>G突变的酶切样本、阴性标本对照是不含有线粒体序列第4435位点发生A>G突变的酶切样本。

2.根据权利要求1所述的一种检测Leber病调控子相关的线粒体DNA突变的试剂盒，其特征在于，在上述试剂盒中，在PCR扩增反应试剂中添加0.1-0.2μl二甲基亚砜。

3.权利要求1所述的一种检测Leber病调控子相关的线粒体DNA突变的试剂盒在检测与Leber病调控子相关的线粒体基因mtDNA A4435G突变中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）基因组DNA的提取：运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片、血滤纸片或唾液的样本中提取基因组DNA；

（2）特异性PCR扩增：使用Primer 5.0软件和Oligo7.0软件根据SEQ ID NO:5所示的人类线粒体基因序列设计引物包含突变位点的基因片段3777-4679，外前向引物F: TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA，外反向引物R: AAG GAT TAT GGA TGC GGT TG；内前向引物F: CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT，内反向引物R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC； 

（3）酶切鉴定：将上述PCR产物用限制性内切酶NlaⅢ对A4435G突变位点处进行酶切； 

（4）突变检测：琼脂糖凝胶电泳检测，直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量及DNA片段大小，检测mtDNA是否发生A4435G突变。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在步骤（1）中，样本来源于从毛细血管静脉血标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片、血滤纸片或唾液，根据取样方式或被测样本形式不同，对不同样本进行预处理，样本预处理方法如下：

（1）血标本或血滤纸片：取20～200μl血标本或1cm²的血滤纸片放入1.5ml Eppendorf管，加入900μl红细胞裂解缓冲液室温静置10min，充分裂解红细胞，12000rpm离心1min，收集白细胞沉淀；所用缓冲液为20mmol/L Tris-HCl，pH 7.6；

（2）带毛囊的毛发：用70%乙醇洗带毛囊的毛发1 次，后再用蒸馏水冲洗毛发2次，在1.5ml Eppendorf管中分别放入2～4 根毛发，毛囊置于Eppendorf管底部，用干净的剪刀剪去毛发高于Eppendorf管的部分；

（3）口腔粘膜刮片或唾液：收集唾液前，必须让被收集者漱口，以除去口腔中过多的老化细胞、食物残渣、牙膏、咖啡、烟，半小时内不喝水、进食、吸烟，然后开始收集口腔粘膜刮片或唾液，选择如下方法收集唾液样本：①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞，将0.1ml唾液直接吐进Eppendorf管内；②生理盐水漱口，吐进Eppendorf管内，吸取PBS溶液至装有通过上述任一种方法收集的唾液样本的Eppendorf管中，反复吹打后，12000rpm离心5min，除去上清，重复该过程一次；③用棉拭子反复刮拭面颊内壁6次，空气中干燥，然后用灭菌过的镊子小心撕去其外表面，放入Eppendorf管中；④将唾液吐在滤纸上，空气中干燥后形成唾液斑，再用干净的剪刀剪成1cm²碎纸片置于Eppendorf管中。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在步骤（1）中经过预处理后，用细胞裂解液和蛋白酶K对上述样本进行消化裂解，再盐析法去除蛋白等杂质，异丙醇沉淀DNA，最后用高压灭菌水或TE缓冲液溶解后于-20℃保存备用。