[发明专利]一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用。 

背景技术

原位杂交技术是根据核酸分子碱基互补原则，将标记的DNA或RNA探针与经过变性后的单链DNA片段或组织、细胞上特定的核苷酸序列，在适宜条件下结合形成专一的核酸杂交分子，再经过相应的检测手段，将待测核酸在染色体、组织或细胞上的位置显示出来。原位杂交技术是由Gall和Parue(1969)利用标记的rDNA探针与非洲爪蟾细胞核杂交首次获得成功。随着植物染色体制备技术的改进，Rayburn(1985)最早将非放射性检测系统应用到植物染色体原位杂交。目前，该技术在基因定位、多倍体起源、非整倍体鉴定以及系统进化和亲缘关系等方面均得到广泛应用。 

现有的原位杂交探针包括DNA探针、寡聚核苷酸探针、RNA探针，这些探针需要信号级联放大反应才能观察结果，而且要有一定的Tm值才能保证实验的正确性和准确性。而且为了增强信号，目前多采取长的核酸序列做为探针的靶向序列或采用信号扩大系统。 

miRNA是短的非编码的RNA，是致癌基因或抑癌基因的潜在调节子。RT-PCR、Northern印迹法以及生物芯片可以检测miRNA的表达量，但是并不能检测在单个细胞中miRNA的表达也不能在原位研究moRNA的表达，达到研究miRNA在癌细胞增殖或凋亡的机制的目的。为了验证miRNA表达的特异性以及它在癌细胞或癌组织中的定位，需要进行原位杂交。针对miRNA，因为miRNA的片段长度在18－22nt范围内，比较小，Tm值比较小不能满足原位杂交的需要，以上方法均不能很好的解决这些问题。目前，为了解决Tm值偏小，丹麦的一家公司生产检测miRNA的探针，他们的探针是将碱基五碳环上2’氧4’碳亚甲基连接，然后人工合成，该方法有效提高了Tm值，但是其售价昂贵。 

发明内容

为克服上述技术缺陷，并降低经济成本，本发明的目的是提供一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用。 

为实现上述目的，采用如下的技术方案： 

本发明提供了一种miRNA的原位杂交探针，所述杂交探针的碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。修饰的探针是其大部分碱基进行2-F修饰，即在第2位碳原子上修饰一个氟原子，提高Tm值；用长18-22nt的序列和microRNA互补作为探针将修饰后的RNA合并到到探针中。其中，修饰位点如下式： 

被氟原子修饰的RNA被合并到所涉及的miRNA探针中 

优选的，所述杂交探针的序列为5’－3’：AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA，其中第3、6、15、20个碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。 

优选的，所述杂交探针的序列为5’－3’：TCACGCGAGCCGAACGAACAAA，其中第3、8、13、21个碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。 

上述杂交探针的5’和3’端修饰地高辛。 

本发明还提供了一种含有上述的杂交探针的miRNA的原位杂交检测试剂盒。该还包括对照探针、预杂交液、封闭液和标记物。 

对照探针的序列为5’－3’：AGTCTATGGTATTCAGTACTCA。 

所述预杂交液20ml中含20×SSC 4ml、硫酸葡聚糖4g、去离子甲酰胺10ml、Poly A(10mg/ml)0.5ml、鱼精ssDNA(10mg/ml)0.5ml、tRNA(10mg/ml)0.5ml、1M二硫代苏糖醇(DTT)2ml、50×Denhardt’s 0.2ml；所述封闭液为：PBS中加入0.1%Triton-X100、3%正常山羊血清、3%BSA；所述标记物为碱性磷酸酶荧光底物。 

本发明所提供的第一种优选探针，其序列为5’－3’：AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA，该探针可以应用于制备肺癌细胞系或肺癌组织的miRNA原位杂交检测试剂盒中。 

第二种优选探针，其序列为5’-3’：TCACGCGAGCCGAACGAACAAA，该探针可以应用于制备食管癌细胞系或食管癌组织的miRNA原位杂交检测试剂盒中。 

本发明的检测原理如下：本发明的检测系统采用了碱性磷酸酶底物发光检测系统，根据目的核酸模板，设计地高辛标记的2F探针，与目的核酸进行杂交，然后与抗地高辛碱性磷酸 酶复合物进行孵育，洗涤，最后用碱性磷酸酶荧光底物显色，阳性结果则发出黄绿色荧光。